Search Thermo Fisher Scientific
.png)
Datos de rendimiento y aplicación para contadores de células automatizados Countess
Los datos de rendimiento muestran que los contadores de células Countess 3 producen recuentos exactos y precisos en una amplia gama de tipos de células y desafíos. Los datos de aplicación muestran el tipo de resultados que los investigadores pueden esperar en estudios de viabilidad, apoptosis, eficacia de transfección, cultivo de células CAR-T, transducción CRISPR, etc.
Para obtener datos de aplicación adicionales, descargue las notas de la aplicación en esta página, así como en Recursos.
Algunos datos de esta sección se han extraído de los instrumentos Countess II. Esperamos que los datos equivalentes de los instrumentos Countess 3 sean tan buenos o mejores que los de Countess II.
Exactitud y precisión del recuento de células
Tipos de células difíciles
Los algoritmos de aprendizaje por máquina dan como resultado recuentos de células altamente exactos con tipos de células difíciles y con mejor precisión que el recuento manual.
Las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) humanas y murinas, notablemente difíciles de contar debido a su pequeño tamaño y bajo contraste, se contaron (arriba) con el Countess Automated Cell Counter 3 FL (barras azules) y manualmente con un hemocitómetro y microscopio (barras verdes). Todas las barras representan seis recuentos. Las barras de error representan desviaciones estándar, que son significativamente mayores para los recuentos manuales. Las imágenes (abajo) muestran CMSP humanas (izquierda) y murinas (derecha) identificadas y contadas.
Células grumosas
Los algoritmos de aprendizaje por máquina generan recuentos precisos con células grumosas y residuos de muestras.
El Countess Automated Cell Counter 3 FL se usó en modo de campo brillante para contar células RAW (macrófago de ratón), que son pequeñas y proclives a formar grumos. Se empleó la tinción azul de tripano para establecer la viabilidad. La figura muestra tanto la imagen sin procesar (izquierda) como la imagen mejorada (derecha), en la que las células vivas se contornean en verde y las células muertas, en rojo. El algoritmo de recuento pudo resolver las células en los grumos y segmentarlas y contarlas correctamente. El residuo fue reconocido y excluido automáticamente de los recuentos.
Viabilidad
Viabilidad de las CMSP murinas en modo de campo brillante y de fluorescencia.
Los contadores de células automatizados Countess 3 y Countess 3 FL se utilizaron en modo de campo brillante y de fluorescencia para contar CMSP murinas, que pueden ser de tan solo 5 µm. En el recuento de campo brillantes (izquierda), se utilizó una tinción de azul de tripano (0,4 %) para distinguir la viabilidad. El contador de células Countess 3 encierra las células vivas (translúcidas) en contornos (círculos) verdes y las células muertas (tintadas en profundidad) en contornos rojos para indicar su viabilidad.
En el modo de fluorescencia (derecha), el ensayo de naranja de acridina y yoduro de propidio (AO/PI) da como resultado una mayor especificidad del estado vivo/muerto. El AO tiñe de verde todas las células vivas nucleadas, que se pueden detectar con el cubo de luz EVOS GFP 2.0, mientras que el PI tiñe de rojo las células muertas, que se pueden detectar con el cubo de luz EVOS Texas Red 2.0. Este es un caso en el que la tinción de fluorescencia es una medida de viabilidad más precisa que el azul de tripano.
Apoptosis
Detección de células apoptóticas y muertas en modo de fluorescencia.
Después de la incubación con estaurosporina 2 y 4 µM, las células de USO2 (epiteliales de osteosarcoma humano) se marcaron con el reactivo de detección CellEvent Caspase-3/7 Green 1:400 para identificar las células apoptóticas, y luego se tiñeron con la tinción de células muertas SYTOX Red 1:1.000 para denotar todas las células muertas. Las células se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos y se contaron en un Countess Automated Cell Counter 3 FL equipado con cubos de luz LED EVOS, GFP 2.0 y Cy5 2.0. Tanto la señal verde con la de rojo lejano aumentaron cuando lo hicieron las dosis del fármaco, lo que indica aumentos significativos en la apoptosis y en la muerte celular, respectivamente. Los porcentajes para 4 µl de la estaurosporina suman más del 100 %, ya que el 16 % de las células que expresan ambas tinciones se cuentan en las tres categorías.
Eficacia de la transfección
Con el Countess Automated Cell Counter 3 FL, puede verificar rápidamente qué proporción de células se han transfectado o transducido con éxito antes de pasar a experimentos y análisis posteriores.
Eficacia de transducción medida por citometría de flujo frente al recuento de células automatizado.
Las células U2OS se transdujeron mediante Invitrogen CellLight Nucleus-GFP, BacMam 2.0 y se permitió su incubación durante 36 horas. Se evaluaron las células para la expresión de proteínas fluorescentes mediante citometría de flujo (gráfica, izquierda) y (imagen, derecha) un recuento celular automatizado Countess II FL con un cubo de luz GFP. Los porcentajes de transducción determinados por los dos métodos son prácticamente idénticos: 49,5 % frente a 49 %.
Control de calidad del cultivo celular durante la expansión de células CAR-T
Al expandir los linfocitos T para la investigación y el desarrollo de nuevas inmunoterapias tales como CAR-T, es importante evaluar rápidamente el estado de los linfocitos T en una pequeña muestra de células para garantizar la máxima viabilidad. El Countess Automated Cell Counter 3 FL puede proporcionar mediciones rápidas y precisas de la viabilidad y concentración celular antes y después del aislamiento y la activación, lo que ahorra tiempo y valiosas células para experimentos futuros.
Control de calidad del cultivo de células CAR-T.
Las células CAR-T se aislaron con el Dynabeads Untouched Human T Cells Kit y se activaron conDynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation. El cultivo celular se monitorizó antes y después de la expansión usando el recuento de campo brillante contando con tinción azul de tripano en el Countess Automated Cell Counter 3 FL. En imágenes (izquierda) e histogramas (derecha), los linfocitos T y los gránulos se diferencian automáticamente, apareciendo los linfocitos T como vivos (verdes) y los gránulos como muertos (rojos). Los gránulos también se pueden eliminar manualmente en función del tamaño y la intensidad, si se desea.
Viabilidad y eficacia de transducción de células transducidas CRISPR-Cas9
En experimentos de edición del genoma con CRISPR-Cas9, la transducción lentiviral suele utilizarse para administrar el complejo CRISPR-Cas9 de manera eficiente al interior de las células. Controlar las partículas que expresan una proteína fluorescente (como la GFP), y eliminar potencialmente otros genes (como HPRT), se utilizan con frecuencia para medir la eficacia de la transducción. El Countess Automated Cell Counter 3 FL se puede utilizar para cuantificar tanto la viabilidad como la eficacia de la transducción en estas células.
Eficacia de transducción lentiviral medida por la expresión de GFP.
Las células U2OS que expresan la proteína Cas9 se transdujeron con LentiArray CRISPR Positive Control Lentivirus, HPRT humano, con GFP y un lentivirus de control negativo (scramble, GFP) a una multiplicidad de infección (MOI) de 1 y 2. Dos días después, las células se contaron con el contador de células Countess II FL para la expresión de GFP. (Izquierda) Visualización de resultados de recuento representativos en el instrumento Countess II FL. (Derecha) Los gráficos de barras muestran los porcentajes de células positivas para GFP, lo que indica una transducción correcta.
Verificación de muestras y tinción para la citometría de flujo y la clasificación de células
Muchos protocolos de citometría de flujo y clasificación celular recomiendan una concentración o intervalo de células específicos para una tinción y un análisis óptimos. Un paso preliminar con un Countess Automated Cell Counter 3 antes de la citometría de flujo o la clasificación celular asistida por fluorescencia (FACS) puede aumentar el éxito experimental y potencialmente ahorrar tiempo, dinero y muestras valiosos. Puede verificar rápidamente que (a) tiene suficientes células para completar el protocolo, (b) ha utilizado la cantidad óptima de reactivo de tinción, (c) no ha perdido un número significativo de células durante la tinción, y (d) las células se han teñido o transducido de forma eficaz.
Para uso exclusivo en investigación. No apto para uso en procedimientos diagnósticos.