Microscopía electrónica de barrido con haz de iones focalizado en plasma

¿Por qué utilizar el PFIB-SEM para microscopía electrónica volumétrica? 

La microscopía electrónica de barrido por fresado con haz de iones focalizado en plasma (Plasma-FIB SEM) combina una mayor eficacia de pulverización con una resolución de imagen nanométrica a temperatura ambiente o en condiciones criogénicas. Esto puede proporcionar un punto final rápido durante la adquisición de imágenes en 3D. Las múltiples especies de iones (Xe, O, Ar y N) son opciones versátiles para la eliminación de grandes volúmenes de material y en lugares específicos.  Por ejemplo, O+ PFIB ofrece una eficacia de obtención de datos y una calidad de imagen superiores para muestras integradas en resinas de base epoxi o acrílica. A diferencia de los FIB con base de Ga, las superficies sin cortina se generan fácilmente para una amplia gama de materiales como las resinas LR-White, HM20 y EPON. La compatibilidad superior con el procesamiento de resinas y muestras permite la tomografía FIB-SEM dirigida con imágenes correlativas directas en la resina de la región de interés (ROI). La localización de la ROI se puede mejorar aún más mediante microscopía óptica y electrónica correlativa (CLEM). La gestión de datos de los cortes está automatizada.

Volumen en 3D de neurona de ratón que contiene vesículas sinápticas y mitocondrias (coloreadas) HPF en EPON.

¿Cómo funciona el PFIB-SEM para la microscopía electrónica volumétrica?

Thermo Scientific Helios 5 Hydra DualBeam es una herramienta versátil para la tomografía FIB-SEM celular de alto rendimiento, compatible con todos los medios de inclusión de muestras y protocolos de preparación utilizados habitualmente. Se pueden utilizar cuatro especies de iones (Xe, O, Ar y N) de forma independiente para la eliminación de grandes volúmenes de material en lugares específicos para el análisis descendente y transversal en 2D y 3D. Al seleccionar el haz de iones que se ajuste a los requisitos de cada muestra individual, se puede conseguir una excelente textura superficial para muestras complejas, incluidas las interfaces muestra-sustrato y los materiales dentales (tejido mineralizado).

 

Un FIB en plasma permite un corte en secciones en serie eficiente y de gran volumen gracias a un haz más amplio y colimado que proporciona corrientes hasta 2,5 μA superiores a las de un Ga-FIB. La mejora de la eficacia de la pulverización aumenta el rendimiento, ya que genera caras de corte más suaves y reduce los artefactos de cortina; además, mejora aún más el rendimiento y proporciona un acceso rápido a las regiones de interés. La combinación de corrientes más altas, la velocidad de pulverización más elevada y los daños reducidos hace posible acceder a volúmenes de cientos de micrómetros sin dejar de observar características a nanoescala.

Método Spin Mill PFIB para fresado y adquisición de imágenes planas de gran tamaño

El método opcional Spin Mill del Helios 5 Hydra DualBeam proporciona un fresado plano de grandes áreas de hasta 1 mm de diámetro y la capacidad de adquirir imágenes de grandes áreas en un plano horizontal para la caracterización en 3D. El proceso Spin Mill está totalmente automatizado y es fácil de configurar mediante el software Thermo Scientific Auto Slice & View. Se pueden seleccionar varias áreas para la adquisición de imágenes dentro de un experimento de Spin Mill. Se pueden obtener imágenes de cada área de interés con diferentes ajustes de imagen en función de la especificidad del experimento. 

 

Con Spin Mill, las muestras se fresan en un ángulo de visión casi oblicuo con el PFIB; no se requiere la preparación habitual de la muestra para el análisis de corte y visualización (por ejemplo, recubrimiento protector, zanjas o el uso de marcas fiduciales). Con una superficie fresada tan grande, se pueden seleccionar y adquirir imágenes de numerosas regiones. Las características dispersas se pueden identificar fácilmente y se pueden obtener datos en 3D estadísticamente relevantes de varias áreas.

La microscopía correlativa combina el PFIB-SEM con la microscopía óptica de fluorescencia

El sistema correlativo Thermo Scientific iFLM es un microscopio óptico de campo amplio integrado para la adquisición de imágenes criocorrelativas en el interior del Helios 5 Hydra PFIB, lo que le permite combinar la adquisición de imágenes de fluorescencia y el fresado de iones en un solo microscopio para la microscopía óptica y electrónica correlativa (CLEM) a temperatura ambiente o en condiciones criogénicas.

Galería de muestras de PFIB-SEM 3D

Hipocampo de ratón visualizado con el método Spin Mill

El método Spin Mill permite el fresado de grandes áreas para revelar detalles de la muestra de alta resolución que se pueden analizar después para centrarse en las regiones de interés. Cultivo de cortes organotípicos de hipocampo de ratón, HPF, resina congelada EPON. Cortesía de S. Watanabe, Universidad John Hopkins y J. Wang, Thermo Fisher Scientific.

Conozca a los científicos que utilizan el PFIB-SEM para microscopía electrónica volumétrica

«Cada vez nos enfrentamos a más retos para entender cómo mejorar la resistencia de los cultivos al estrés ambiental y a las enfermedades.  Las extraordinarias capacidades de nuestra nueva Hydra vEM nos permitirán la posibilidad sin precedentes de reconstruir células y tejidos vegetales enteros con un detalle exquisito. Esta tecnología nos permitirá "congelar" organismos en el tiempo y el espacio y construir intrincados modelos en 3D que nos ayudarán a resolver nuestros retos cruciales de seguridad alimentaria».

 

Kirk J. Czymmek, investigador principal, director laboratorio avanzado de Bioimagen, Centro de Ciencias Vegetales Donald Danforth

Recursos de PFIB-SEM

Thermo Scientific Helios 5 Hydra DualBeam es un PFIB-SEM versátil con múltiples especies de iones para el análisis de microscopía electrónica volumétrica.

Cuando se preparan muestras biológicas para su análisis, el método de preparación de la muestra y el tipo de resina determinan el grado de conservación de las estructuras subcelulares y las señales fluorescentes.

En esta nota de aplicación, describimos el método Spin Mill para el fresado plano de grandes áreas con PFIB de oxígeno para acceder e investigar grandes áreas (hasta 1 mm).

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.