Datos del rendimiento y la aplicación para el clasificador de células espectrales Bigfoot

Los datos de rendimiento muestran que el clasificador de células espectrales Bigfoot resuelve las señales fluorescentes de forma precisa y exacta. Los datos de aplicación muestran el nivel de resolución de sincronización y pureza de clasificación necesarios para los estudios de inmunofenotipado y expresión de marcadores.

 

Para obtener datos de aplicación adicionales, descargue las notas de aplicación que figuran en esta sección y en la página Recursos.


Resolución de microesferas de 8 picos

Las microesferas de 8 picos Spherotech™ que se ejecutan en canales clave en el clasificador de células espectrales Bigfoot muestran picos estrechos y bien definidos.

Resolución de microesferas de 8 picos en canales clave.


Panel de inmunofenotipado profundo de 23 colores con expresión Siglec

Se ha observado en estudios recientes que diferentes miembros de la familia de receptores de lectinas de tipo inmunoglobulina que se unen al ácido siálico (Siglec) se expresan mediante diferentes leucocitos en diversas etapas de desarrollo y activación. Las interacciones entre el ácido siálico y las Siglec son inmunosupresoras y ayudan a las células inmunitarias a distinguir entre sí mismas y las distintas, ya que los microrganismos patógenos a menudo carecen de ácidos siálicos.

 

En este experimento, los investigadores del Instituto de Investigación Scripps utilizaron un clasificador de células espectrales de Bigfoot con 5 láseres para explorar de qué modo los receptores de Siglec se expresan mediante diferentes subconjuntos de leucocitos aislados de células esplénicas murinas. Los subconjuntos de leucocitos principales se clasificaron en función de esas asociaciones.

 

Utilizando las herramientas de diseño de paneles del software Sasquatch, como el gráfico de firmas espectrales y el cálculo de complejidad, los investigadores diseñaron un panel espectral de 23 colores con 15 colores para inmunofenotipado, siete para marcadores de Siglec y uno para discriminación entre células vivas y muertas. El análisis espectral ofreció opciones adicionales de fluoróforos que no hubieran sido posibles mediante la compensación convencional, como la combinación de FITC y Alexa Fluor 532 en el mismo panel. Todos los reactivos estaban disponibles para la venta de una amplia gama de fabricantes.

Panel de 23 colores que explora la expresión de las Siglec de subconjuntos leucocitarios

Láser

Antígeno

Etiqueta

Fabricante

N.º cat.

Clon

349

Siglec-F

BUV395

BD Biosciences

740280

E50-2440

349

Tinción de células muertas azul fijables LIVE/DEAD

Thermo Fisher Scientific

L23105

N/A

349

CD8a

BUV496

BD Biosciences

750024

53-6,7

349

CD62L

BUV563

BD Biosciences

741230

Mel-14

349

Siglec-E

BUV615

BD Biosciences

752326

750620

349

Siglec-H

BUV661

BD Biosciences

749806

440c

349

CD44

BUV737

BD Biosciences

612799

Im7

405

F4/80

BV421

BD Biosciences

565411

T45-2342

405

CD11b

BV570

BioLegend

101233

M1/70

405

CD80

Super Bright 600

Thermo Fisher Scientific

63-0801-82

16-10A1

405

Siglec-G

BV650

BD Biosciences

745364

SH1

405

I-A/I-E

BV711

BioLegend

107643

M5/114.15.2

405

CD25

BV785

BioLegend

102051

PC61

488

Siglec-1

Fluoresceína (FITC)

Bio-Rad

MCA947F

MOMA-1

488

CD11c

Alexa Fluor 532

Thermo Fisher Scientific

58-0114-82

N418

488

Ly6C

PerCP-Cy5.5

Thermo Fisher Scientific

45-5932-82

HK1.4

561

Siglec-2

FC

BioLegend

126111

OX-97

561

CD4

FC-Texas Red

Thermo Fisher Scientific

MCD0417

RM4-5

561

NK1.1

FC-Cy5

BioLegend

108716

PK136

561

Siglec-3

FC-Cy7

Thermo Fisher Scientific

25-0331-82

9A11-CD33

561

CD3e

FC-Cy5.5

Thermo Fisher Scientific

35-0031-82

145-2C11

640

CD19

APC

Thermo Fisher Scientific

17-0193-82

eBio1D3 (1D3)

640

Ly6G

APC-eFluor 780

Thermo Fisher Scientific

47-9668-82

1A8-Ly6g

La figura muestra ejemplos de estrategia y análisis de sincronización (descritos completamente en nuestro documento técnico). A la izquierda, se identificaron monocitos y macrófagos mediante las expresiones CD11b, F4/80 y Ly6c. A la derecha, se utilizó Siglec-F en combinación con CD11c y Ly6G para identificar células dendríticas (CD11c+siglec-F-), eosinófilos (CD11c-siglec-F+) y neutrófilos (CD11c-siglec-F-Ly6G+). La expresión de Siglec se correspondió con patrones esperados de experimentos previos.

Diagramas de puntos para poblaciones leucocitarias de macrófagos, células dendríticas, granulocitos

Identificación de tipos de células mieloides.

 

(A) La población de singletes del FSC se analizó con CD11b BV570 frente a CD11c Alexa Fluor 532 para determinar la población de CD11b⁺. (B) La población de CD11b⁺ se analizó con F4/80 BV421 frente a SSC para identificar monocitos y macrófagos. (C) La población CD11b⁺ se analizó con Ly6C PerCP-Cianina 5.5 frente a SSC para identificar monocitos. (D) La población CD11b⁺ se analizó más a fondo con CD11c Alexa Fluor 532 frente a Siglec-F BUV395 para identificar células dendríticas y eosinófilos. (E) La región de doble negativo CD11c, Siglec-F se analizó con Siglec-F BUV395 frente a Ly6G APC-eFluor 780 para identificar y clasificar neutrófilos. Mientras que las células dendríticas y los neutrófilos se clasificaron correctamente, los recuentos totales fueron extremadamente bajos.

Al utilizar las regiones de sincronización, los investigadores clasificaron seis poblaciones: linfocitos T CD4 y CD8, linfocitos B, linfocitos NK, células dendríticas y neutrófilos. Para verificarlo, hicieron comprobaciones de clasificación de los tubos de recogida en un analizador espectral de 5 láseres independiente fabricado por un competidor. La figura muestra que las cuatro poblaciones principales alcanzaron una pureza del 96 % o superior. Las células dendríticas y los neutrófilos también se clasificaron correctamente, pero no se pudieron mostrar debido a poblaciones de células pequeñas o problemas de viabilidad no relacionados con la clasificación.

Reanálisis de tubos de recogida.

Después de la clasificación, los tubos de recogida se volvieron a analizar para obtener su pureza mediante un analizador espectral de una instalación independiente y se importaron los datos en el software FlowJo para su visualización. (A) La región CD4 mostró una pureza del 99,3 % para el tubo de recogida de CD4+ PE-Texas Red. (B) La región CD8a mostró una pureza del 98,7 % para el tubo de recogida CD8a+ BUV496. (C) La región CD19 mostró una pureza del 96,9 % para el tubo de recogida CD19+ APC. (D) La región NK1.1 mostró una pureza del 98,7 % para el tubo de recogida NK1.1+ FC-Cy5.


Panel de inmunofenotipado de PBMC de 15 colores

Este experimento muestra el inmunofenotipado de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en un clasificador de células espectrales Bigfoot con 5 láseres. Hemos diseñado un panel espectral de 15 colores para diferenciar y clasificar los principales tipos de células sanguíneas y mostrar la expresión de marcadores clave.

 

La figura muestra ejemplos de estrategia y análisis de sincronización (descritos completamente en nuestro documento técnico). El panel A muestra la selección de clasificación de los linfocitos T reguladores raros (Tregs), mientras que los paneles B y C muestran patrones de perfiles de expresión de CD45RA, CD45RO y TCRγδ.

Subtipos de linfocitos T y expresión de marcador.

(A) Los linfocitos T auxiliares CD4 fueron analizados para la expresión CD25 y CD127 para clasificar los Tregs raros (CD25+CD127-). (B) En los linfocitos T auxiliares CD4 seleccionados se analizaron los perfiles indiferenciados (CD45RA+) y la expresión de linfocitos T de memoria (CD45RO+). (C) Los linfocitos T CD3 seleccionados se analizaron en busca de perfiles de expresión TCRγδ.

Utilizando las regiones de clasificación seleccionadas como la selección Treg anterior, se clasificaron seis poblaciones: Linfocitos T CD8+ y citotóxicos, linfocitos B, linfocitos NK, monocitos y Tregs. Para la verificación posterior a la clasificación, cada tubo de recogida se volvió a analizar para calibrar su pureza. El análisis de las poblaciones de clasificación (cuatro de las cuales se muestran en la figura) mostró que la capacidad de desmezclado espectral del clasificador de células espectrales Bigfoot produjo resultados con una alta eficiencia y más del 98 % de pureza. Este rendimiento en la clasificación es equivalente a los clasificadores que utilizan la compensación tradicional, lo que permite a los usuarios realizar una transición sin problemas entre los dos métodos a medida que aumenta la complejidad experimental.

Reanálisis de tubos de recogida.

Después de la clasificación, se volvieron a analizar los tubos de recogida para determinar la pureza, y se mostraron poblaciones bien definidas de (A) linfocitos T CD8 (CD8strong), (B) monocitos (CD14+), (C) linfocitos B (CD19+CD20+) y (D) linfocitos T citotóxicos (CD8dimCD56+).


Diferenciación de células sanguíneas mediante dispersión de luz

Aunque la polarización es una propiedad de la luz láser que se suele ignorar en la citometría de flujo, puede ser útil para diferenciar determinados tipos de células. Por ejemplo, los granulocitos de eosinófilos en sangre humana muestran niveles relativamente más altos de luz láser despolarizada en un detector de dispersión lateral (SSC) debido a sus propiedades birrefringentes. El análisis de la polarización también ha sido útil en el diagnóstico de la malaria y en los estudios de fitoplancton marino.

 

Todos los modelos del clasificador de células Bigfoot incluyen detectores adicionales FSC (dispersión frontal) y SSC para la detección de luz despolarizada. La figura muestra el uso del detector despolarizado SSC para identificar eosinófilos en sangre completa humana lisada. Esta diferenciación no requiere tinción, de modo que no se alteran las células y se ahorra dinero en fluoróforos. Al añadir una tinción para CD16, también se pueden identificar otras poblaciones celulares.

Análisis de las poblaciones de células sanguíneas mediante dispersión de luz y CD16.

Se adquirió sangre completa humana lisada normal y se analizó con un clasificador de células espectrales Bigfoot. (A) El gráfico de puntos polares SSC x SSC muestra eosinófilos, con una SSC despolarizada más alta, en rojo. (B) El gráfico de contorno FSC x SSC muestra eosinófilos con alta señal de FSC y SSC debido a su mayor tamaño en comparación con otras células. (C) Una muestra sin teñir muestra la autofluorescencia de los eosinófilos en el canal BV510. (D) El gráfico de puntos de las células teñidas CD16 BV510 muestra eosinófilos CD16 negativos y destaca otras poblaciones celulares basadas en la expresión de CD16.


No se puede revender. Los colorantes de polímero Super Bright se venden con licencia de Becton, Dickinson and Company.
Para uso exclusivo en investigación. No apto para uso en procedimientos diagnósticos.