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CellROX Deep Red、CellROX Green 和 CellROX Orange 三种 Invitrogen Molecular Probes 荧光试剂可用于检测和定量活细胞中的活性氧（ROS）。每种试剂都具有细胞膜通透性并且在还原状态下不发荧光或荧光非常微弱。氧化后，试剂发出强烈的荧光并继续存留在细胞内。
这些ROS传感器可与多种实验平台兼容，包括流式细胞仪、显微镜、高内涵成像和基于微孔板的荧光酶标仪，以及Attune声波聚焦流式细胞仪和Floid细胞成像站。
与传统的二氢二氯荧光素染料（如 H2DCFDA）相比，CellROX 试剂具有明显的优势，例如：
- 荧光探针—CellROX 试剂在细胞中氧化时会发出明亮的荧光，可进行灵敏检测
- 多色兼容性—与其他激光激发的荧光染料重叠最小，可轻松与其他试剂联用
- 简便—细胞可以在完全培养基或其他合适的缓冲液中染色；不需要无血清培养基
- 可固定—CellROX Green 和 CellROX Deep Red 试剂在甲醛固定后仍保留信号（CellROX Orange 试剂不能固定）
- 灵活—试剂具有3种不同的荧光颜色，便于实验设计
表 1显示了这些特点的比较。 请参阅我们的氧化应激选择指南查看更多ROS检测产品。
表1. 几种荧光氧化应激传感器的特点。
特点 | H2DCFDA | DHE | |||
|---|---|---|---|---|---|
| 最大激发/发射波长 (nm)* | 485/520 | 545/565 | 644/665 | 504/529 | 518/605 |
| 可以添加到培养基 | 是 | 是 | 是 | 否 | 是 |
| 醛固定 | 是 | 否 | 是 | 否 | 否 |
| 耐洗涤剂 | 是 | 否 | 否 | 否 | 否 |
| 光稳定 | ++ | ++++ | +++ | + | NA |
| 多重 | 是 | 是 | 是 | 是 | 否† |
| 兼容 GFP | 否 | 是 | 是 | 否 | 否 |
| 兼容 RFP | 是 | 否 | 是 | 是 | 否 |
| * 氧化试剂的最大激发和发射波长 (nm)，在某些情况下与双链DNA结合。† 与 DNA 结合的氧化 DHE 的荧光发射光谱非常宽，难以与其他荧光探针联用。 H2DCFDA = 2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯。 DHE = 二氢乙锭。 NA = 数据不可用。 | |||||
除单独的试剂外，我们还开发了经验证可用于流式细胞分析的试剂盒，包括：
- 抗氧化剂（N-乙酰半胱氨酸[NAC]，作为阴性对照）
- 氧化剂（叔丁基过氧化氢 [TBHP]，作为阳性对照）
- 与 CellROX 试剂兼容的SYTOX 死细胞染色剂
当 CellROX 试剂与 SYTOX Red 死细胞染色剂（或 SYTOX Blue 死细胞染色剂与 CellROX Deep Red 试剂）联用时，使用流式细胞可准确的区分氧化应激和非应激细胞与死细胞。
图1：使用流式细胞仪检测活性氧（ROS）。(A)使用 NAC 对培养物进行预处理后，CellROX Deep Red 试剂检测到的 TBHP 处理 Jurkat 细胞 ROS 水平降低。与用 NAC（蓝色）预处理的细胞和对照细胞（绿色）相比，经过氧化剂 TBHP（红色）处理的细胞在使用 CellROX Deep Red 试剂时染色加深。(B, C)CellROX Deep Red 试剂可与 SYTOX Blue 死细胞染色剂结合使用，以区分活细胞和死细胞。将 Jurkat 细胞用 (B)PBS 或 (C) 200 μM TBHP 处理30分钟，然后用>CellROX Deep Red 流式细胞分析试剂盒标记。注意，处理细胞 (C) 观察到的氧化应激细胞百分比高于对照细胞 (B) 基础 ROS 水平。
所有三种 CellROX 试剂均可产生可通过传统显微镜（图2）和高内涵成像（图3）检测到的一致明亮和光稳定的荧光，并有效地成像和定量细胞氧化应激。 这些试剂产生的信号对于活性氧物质检测具有特异性，如通过细胞与N-乙酰半胱氨酸预孵育时信号衰减。
图 2：使用荧光显微镜检测ROS。将人类主动脉平滑肌（HASM）细胞置于35 mm玻璃底平皿（MatTek）中，作为对照不处理或用500 nM血管紧张素II在37°C孵育4小时。最后30分钟的孵育时加入Hoechst 33342和CellROX Green 试剂（顶行）或CellROX Orange 试剂（底行）。然后用PBS洗涤细胞3次，并使用40x物镜在 ZexiAxiovert倒置显微镜上成像。经过血管紧张素 II 处理后观察到CellROX信号增加，表明经处理细胞中的氧化应激增加。
图 3：使用高内涵成像检测ROS。牛肺动脉内皮 (BPAE) 细胞置于96孔板中，不处理或用 100μM 甲萘醌在 37°C 处理1小时以诱导氧化应激。此外，一部分对照和甲萘醌处理的孔再使用 50μM N-乙酰半胱氨酸（NAC，一种 ROS 去除剂）处理。然后将细胞用5 µM CellROX Green 试剂和Hoechst 33342在完全培养基中 37°C 染色 30 分钟，用PBS洗涤，并在Thermo Scientific Cellomics ArrayScan VTI上成像。当 NAC存在时观察到荧光信号减弱，证实了CellROX Green信号的产生是由于样品中存在ROS。
