新版药典三部增加多个生物制品通用技术要求，针对市场上受到关注的重组单抗类、激素类和酶，以及近年来新上市的传统疫苗和创新疫苗等，都有了进一步的更新。基于ICH质量源于设计（QbD）和产品杂质控制，进一步评估和完善已收载品种各论相关质控项目和限度设置的合理性。

赛默飞在生物制药流程的每个阶段拥有创新的解决方案，加速新药从发现、开发、临床研究、生产及质量控制进程，并降低运营成本，实现高效生产，对于生物制品在每一个环节均存在的极其复杂的不确定性，赛默飞都可以提供稳定准确的分析方法。

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糖蛋白糖基化

已上市的蛋白药物中，治疗性糖蛋白药物数量众多，糖基化是最常见的蛋白翻译后修饰。2020版《中国药典》第一增补版中，正式发布9405糖蛋白的糖基化分析指导原则。赛默飞能为糖基化分析提供业内最全方案，可根据糖蛋白的复杂性、与药物安全有效的相关性以及生产监控策略的总体设计等，为糖基化提供完整糖蛋白、糖肽、寡糖、单糖的全面分析。

一级结构分析：糖型分析

糖基化对蛋白药物的疗效、稳定性、免疫原性具有重要的影响。以单克隆抗体为例，如果出现N-糖型以外的糖型，则会影响免疫原性或半衰期，需要避免；另一方面，可以细胞工程及分子生物学技术，提高一些N-糖型的含量，以增强ADCC、CDC、Anti-inflammatory等效能。寡糖为非模板合成，并呈树状结构，其结构极其复杂，仅由6种单糖组成的寡糖链，其理论结构即达到惊人的1012种。这就要求用于寡糖的分析设备具有强悍的分析性能。赛默飞开发了一系列简单、高效的液相色谱-质谱表征方法，涵盖了从糖链结构分析、到糖基化位点鉴定、再到糖肽解析的完整分析流程。

寡糖链分析

ED安培检测器和MS检测N-糖型结果
ED安培检测器和MS检测N-糖型结果

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使用赛默飞Vanguish Horizon UHPLC-FLD对人血清lgG和商业嵌合lgG1单抗(英夫利西单抗)中的n-聚糖进行释放、标记、分离和基于外糖苷酶的结构解析，并使用Q Exactive Plus超高分辨质谱仪对结构进行确认，实现快速和明确的分析。

离子色谱无需衍生，定量准确，可以覆盖分析所有糖类型，N-糖基化修饰的糖链可以通过肽糖苷酶Ｆ或肽糖苷酶Ａ酶切作用，或者肼解作用从糖蛋白上释放出来。糖链经净化后可直接进样，无需衍生，避免了衍生化过程中唾液酸化聚糖的结构改变。

离子色谱还可以和高分辨质谱联用，实现对色谱峰的鉴别。以Q Exactive为代表的Orbitrap超高分辨率质谱对未标记的糖具有高灵敏度，可解析糖链结构。安培检测器、高分辨质谱和离子色谱联用，可同时解决糖链的定性和定量分析。

糖基化位点分析

糖基化位点的发现与确证对质谱的分辨率与灵敏度具有较高要求。Orbitrap由于具有超高分辨率和超高灵敏度，无论对于单抗等纯蛋白样品、还是全细胞蛋白等复杂样品，都是是糖基化位点表征的最佳工具。目前糖基化位点最大的数据集，共从小鼠组织与血浆中注释了6367个糖基化位点。该实验采用用PNGase F释放糖链并标记18O方法，使用Orbitrap鉴定糖基化位点，共鉴定到6367个位13点，其中5753个位点是没有记载的新位点。该研究对糖蛋白糖基化的研究具有重要意义，也展示出了Orbitrap超群的性能。在相对简单的抗体及其他蛋白药物糖基化位点表征中，Orbitrap 更可毫无疑问地胜任此工作。

对于糖结构和糖基化位点信息分析，Orbitrap Eclipse三合一质谱仪拥有CID, HCD, ETD HD, EThcD HD, ETciD, UVPD, PTCR等多种碎裂模式，而且还具有高达50万的分辨率，能够对多种形式的修饰肽段进行精准定性与定量，为研究者提供了更坚实的硬件基础。

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HCP检测

美国药典委员会USP发布了通则<1132.1>质谱法测定生物药中残留宿主细胞蛋白，介绍了质谱技术在HCP检测中的应用，从测试条件的建立、数据的分析、质谱方法验证等多个方面。与ELISA相比，LC-HRMS方法可以鉴定HCP的种类，获得单个HCP的含量信息，可用于不同工艺所得产品的横向对比。

以毕赤酵母发酵的某重组蛋白产品为例，赛默飞展示重组蛋白产品中毕赤酵母残留蛋白的定性和定量分析方法。使用UHPLC系统和高分辨率精确质量（HRAM）质谱仪在宽动态范围内进行HCP检测定性和相对定量，灵敏度可低至1ppm。

变性酶解和native酶解鉴定HCP比较
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对比UHPLC-MS和nanoLC-MS分析native酶解样品中HCP
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人用抗体偶联药物制品

随着生物制药行业的不断发展及抗体类药物的持续创新，国内已经批准上市的ADC药物越来越多，新版药典更新人用抗体偶联药总论。ADC药物在主要利用公用靶点、偶联方式、偶连比、偶连的药物分子及Payload上都有更新。靶点，抗体，毒性分子，连接子的选择与表征成为药物是否成功的关键，检测与表征技术的不断完善也将帮助我们更好的确定药物的真实情况。

DAR (药物抗体比) 指连接到每个抗体的小分子药物的平均数量，影响ADC药物的药效和稳定性，是ADC药物分析的关键质量属性。ADC药物检测项目除了单抗的工艺监控，分析表征和质控，小分子毒素，连接子的检测表征需求外，还有特有的DAR值测定和分布，连接位点的确认，小分子毒素是否与连接子断裂等分析需求。赛默飞领先的色谱质谱技术，帮助您更好的确定药物的真实情况，助力您在这个领域领先一步。

赛默飞ADC药物表征的特色平台方案

赛默飞ADC药物表征

赛默飞ADC药物表征特色平台方案

DAR (药物抗体比) 指连接到每个抗体的小分子药物的平均数量，影响ADC药物的药效和稳定性，是ADC药物分析的关键质量属性。ADC药物检测项目除了单抗的工艺监控，分析表征和质控，小分子毒素，连接子的检测表征需求外，还有特有的DAR值测定和分布，连接位点的确认，小分子毒素是否与连接子断裂等分析需求。赛默飞领先的色谱质谱技术，帮助您更好的确定药物的真实情况，助力您在这个领域领先一步。

具体案例分享：

多种碎裂方式联合解析T-DM1小分子药物偶联位点
多种碎裂方式联合解析T-DM1小分子药物偶联位点

简介：偶联位点的精确解析；T-DM1罗氏上市ADC药物

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用于药物发现和开发的治疗性蛋白药物的表征
用于药物发现和开发的治疗性蛋白药物的表征（LifeArc药物研发机构）

简介：去糖基化ADC分析。LifeArc药物慈善研究机构 CXO案例。简单易用，分析快速轻松。用于小分子到和生物大分子治疗抗体研究，加速进程。

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Orbitrap Exploris 240高分辨质谱完整表征半胱氨酸偶联ADC药物
Orbitrap Exploris 240高分辨质谱完整表征半胱氨酸偶联ADC药物（发表于ASMS2021年会）

简介：变性或非变性条件下，完整分子量和肽图分析。测DAR和分布。利用肽图谱进行了药物偶联位点和偶联位点占据完整的表征。。

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使用Q Exactive 系列高分辨质谱对ADC与mAb进行变性及非变性条件下分子量测定
使用Q Exactive 系列高分辨质谱对ADC与mAb进行变性及非变性条件下分子量测定

简介：非变性质谱(Native MS)是一种近年来得到不断发展和推广的新兴分析技术，可以再保持蛋白非共价作用力条件下进行分子量测定，采用非变性质谱进行半胱氨酸偶联 ADC分析显示了强大的应用潜力。

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CE/ESI-MS 用于生物制药的完整解决方案
CE/ESI-MS 用于生物制药的完整解决方案

简介：独特的ZipChip接口模块和强大的Orbitrap高分辨质谱，结合BioPharma Finder软件和ZipChip耗材，为完整的抗体和抗体偶联药物(ADC)、抗体亚基和肽分析提供无缝式CE/ESI-MS全面表征。

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视频课程

 

QE在ADC表征中的应用

课程视频来源：2022年9月8日  生物药研发与质量控制专场线上论坛 ——《QE在ADC类药物表征中的应用》 报告人：荣昌生物 姚雪静 博士 副总裁

人用疫苗杂质控制

新版中国药典发布3309人用疫苗杂质控制技术指导原则，以20版药典三部《人用疫苗总论》为基础，基于我国已上市疫苗产品的杂质控制的实际经验，参考ICH关于风险评估和全生命周期管理理念，从疫苗杂质来源，疫苗杂质控制的原则及策略，包括风险评估、全过程控制、全生命周期管理、不同类型疫苗杂质的控制要点，以及变更事项对疫苗杂质控制等各方面保证疫苗产品质量。赛默飞色谱与质谱针对传统疫苗、重组疫苗和核酸疫苗提供全方位的研发及工艺质控。

工艺相关杂质

工艺相关杂质主要来源于生产用物料，包括生产过程中使用的起始物料，生产过程中引入的原材料，制剂所用辅料以及直接接触药品的内包装材料的浸出物等。

1. 宿主细胞蛋白残留物


随着高分辨质谱技术性能的不断提升，已具有高灵敏度和宽的定量动态范围，以及蛋白质组学技术的飞速发展，可实现对未知蛋白质的高通量定性和定量。

采用赛默飞EASY nLC 1200与Orbitrap系列高分辨质谱仪联用，UPS2中含有48种内标蛋白6个不同浓度，共鉴定其中24种，其实际含量结果如下表，含量范围为0.05-444.88ppm，实际含量>1ng（10ppm）的16种内标蛋白全部鉴定到，实际含量在0.06-0.38ng（0.6-3.8ppm）范围内共鉴定到6种，此方案的灵敏度足以满足生物药领域客户的需求。

2. 疫苗工艺及质量控制解决方案
裂解剂

在疫苗制备过程中加入裂解剂，如乙醚、聚山梨酸酯80、脱氧胆酸钠等，以裂解病毒粒子，再经纯化工艺去除部分病毒成分，以有效降低不良反应，如甲型肝炎灭活疫苗（人二倍体细胞）生产流程中提纯工艺阶段需用去氧胆酸钠进行细胞裂解，疫苗中残留去氧胆酸的含量不得高于20μg/mL。

新版美国药典收录CAD检测器作为去氧胆酸残留和有关物质的方法。CAD检测器结合Acclaim Surfactant色谱柱，可同时对胆酸、去氧胆酸、熊去氧胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸和牛黄脱氧胆酸进行检测，获得高分离度、高灵敏度和重现性的结果。

培养基

牛血清白蛋白用于细胞培养，但它也是一种异种蛋白，残留量偏高的情况下，多次使用能引发机体的过敏反应。药典规定测定病毒类疫苗中残余牛血清白蛋白的含量，应不超过50ng/剂。

采用MabPac SEC体积排阻色谱柱结合生物惰性液相Vanquish对牛血清白蛋进行了直接测定，无需衍生，能有效排除小分子的干扰，可以排除无/弱紫外吸收大分子辅料干扰（如吐温、PEG等），适用于高盐和宽pH范围缓冲液，有效防止蛋白吸附。

佐剂检测

铝佐剂是最早使用的佐剂，也是目前唯一广泛使用的疫苗佐剂，铝佐剂具有便宜、安全、合成简单的优点，但也存在易在体内蓄积、可能刺激I gE 产生、无法生物降解等问题。在疫苗成品中需对铝含量进行检测，如13 价肺炎球菌结合疫苗中铝含量应为 0.15-0.35 mg/ml，吸附白喉疫苗中氢氧化铝不得高于0.3mg/ml。

对于佐剂中Al含量进行检测，AA、ICPOES和ICP-MS方法均具有极高的灵敏度，iCE3000系列AA优异的光学系统结构、高精度控温和背景扣除技术，可将Al元素在石墨炉分析中的发射干扰有效去除；而iCAP Qnova系列ICP-MS专利技术的Q Cell碰撞池结合低质量数剔除技术，能够将Al元素在质谱分析中的多原子干扰做到完全去除，这些技术的使用确保了佐剂中Al检测获得最佳的准确性和稳定性等方法学数据要求。

相关资源

  疫苗研发与工艺质量控制

电荷异构体

对于单抗电荷变异体的测定有多种分析方法，20版中国药典通则3129收录了单抗电荷变异体测定法-全柱成像毛细管等电聚焦电泳法（icIEF法）外，新版中国药典将毛细管等电聚焦电泳（cIEF法）也写入3129通则。

离子交换(IEX)色谱和成像毛细管等电聚焦(iCIEF)或（CIEF），传统上都使用紫外（UV）作为检测器，无法对分离后的电荷变异体进行更深入的鉴定。为了分析电荷异构体的成因，必须进行准确的定性分析，高分辨率质谱（HRMS）是定性蛋白质分析的有力手段之一。 

SCX-MA方法

赛默飞发表了一种以pH梯度为基础的SCX-MS方法，用于单抗的电荷异构体分析，仅需要使用低浓度的挥发性缓冲溶液即可实现单抗及其电荷变异体的洗脱，实现了SCX分离与 MS的联用。此外SCX色谱柱分析100针以上仍然具有较好的重复性和分离度，与在线二维方法相比，该方法更简单，无需搭建复杂的硬件系统和方法设置即可实现电荷异构体的表征。

icIEF-Orbitrp方法

icIEF-Obritrap HRMS在线联用分析或可与传统的LC-MS相结合的离线制备，为在蛋白质治疗开发过程中区分和识别电荷异构体体提供了的便捷和可靠的分析策略。

1）icIEF质谱在线联用，直接且快速地识别 PTM，包括可能影响生物治疗药物安全性和有效性的糖基化和电荷变异体。

2）高效且简便得组份分离后与传统LCMS结合深入表征电荷异构体，以研究您的生物治疗药物的效力、安全性和功效。

icIEF-Orbitrp方法

icIEF-MS在线联用实例：mAb 1

电荷变体分析工作流程

使用 ProPac 3R 色谱柱进行蛋白类药物电荷变体分析

Thermo Scientific™ ProPac™ 3R系列阴离子交换色谱柱和阳离子交换柱，采用了单分散颗粒技术，对于比较难分离的双特异性抗体、ADC、融合蛋白等样品，在比较低的流速下比经典的ProPac系列和MAbPac 系列离子交换柱有更好的酸碱峰分离效果。既节约了分析时间，试剂成本，又提高了分离效率。在四元系统上，搭配Thermo Scientific CX-1 pH梯度缓冲液，可以实现快速盐梯度方法和pH梯度方法开发，可简化对主要产品和杂质进行高分离度分离的方法优化过程

使用 ProPac 3R 色谱柱进行蛋白类药物电荷变体分析

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糖基化对蛋白药物的疗效、稳定性、免疫原性具有重要的影响。以单克隆抗体为例，如果出现N-糖型以外的糖型，则会影响免疫原性或半衰期，需要避免；另一方面，可以细胞工程及分子生物学技术，提高一些N-糖型的含量，以增强ADCC、CDC、Anti-inflammatory等效能。寡糖为非模板合成，并呈树状结构，其结构极其复杂，仅由6种单糖组成的寡糖链，其理论结构即达到惊人的1012种。这就要求用于寡糖的分析设备具有强悍的分析性能。赛默飞开发了一系列简单、高效的液相色谱-质谱表征方法，涵盖了从糖链结构分析、到糖基化位点鉴定、再到糖肽解析的完整分析流程。

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离子色谱无需衍生，定量准确，可以覆盖分析所有糖类型，N-糖基化修饰的糖链可以通过肽糖苷酶Ｆ或肽糖苷酶Ａ酶切作用，或者肼解作用从糖蛋白上释放出来。糖链经净化后可直接进样，无需衍生，避免了衍生化过程中唾液酸化聚糖的结构改变。

离子色谱还可以和高分辨质谱联用，实现对色谱峰的鉴别。以Q Exactive为代表的Orbitrap超高分辨率质谱对未标记的糖具有高灵敏度，可解析糖链结构。安培检测器、高分辨质谱和离子色谱联用，可同时解决糖链的定性和定量分析。

糖基化位点分析

糖基化位点的发现与确证对质谱的分辨率与灵敏度具有较高要求。Orbitrap由于具有超高分辨率和超高灵敏度，无论对于单抗等纯蛋白样品、还是全细胞蛋白等复杂样品，都是是糖基化位点表征的最佳工具。目前糖基化位点最大的数据集，共从小鼠组织与血浆中注释了6367个糖基化位点。该实验采用用PNGase F释放糖链并标记18O方法，使用Orbitrap鉴定糖基化位点，共鉴定到6367个位13点，其中5753个位点是没有记载的新位点。该研究对糖蛋白糖基化的研究具有重要意义，也展示出了Orbitrap超群的性能。在相对简单的抗体及其他蛋白药物糖基化位点表征中，Orbitrap 更可毫无疑问地胜任此工作。

对于糖结构和糖基化位点信息分析，Orbitrap Eclipse三合一质谱仪拥有CID, HCD, ETD HD, EThcD HD, ETciD, UVPD, PTCR等多种碎裂模式，而且还具有高达50万的分辨率，能够对多种形式的修饰肽段进行精准定性与定量，为研究者提供了更坚实的硬件基础。

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以毕赤酵母发酵的某重组蛋白产品为例，赛默飞展示重组蛋白产品中毕赤酵母残留蛋白的定性和定量分析方法。使用UHPLC系统和高分辨率精确质量（HRAM）质谱仪在宽动态范围内进行HCP检测定性和相对定量，灵敏度可低至1ppm。

变性酶解和native酶解鉴定HCP比较
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DAR (药物抗体比) 指连接到每个抗体的小分子药物的平均数量，影响ADC药物的药效和稳定性，是ADC药物分析的关键质量属性。ADC药物检测项目除了单抗的工艺监控，分析表征和质控，小分子毒素，连接子的检测表征需求外，还有特有的DAR值测定和分布，连接位点的确认，小分子毒素是否与连接子断裂等分析需求。赛默飞领先的色谱质谱技术，帮助您更好的确定药物的真实情况，助力您在这个领域领先一步。

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DAR (药物抗体比) 指连接到每个抗体的小分子药物的平均数量，影响ADC药物的药效和稳定性，是ADC药物分析的关键质量属性。ADC药物检测项目除了单抗的工艺监控，分析表征和质控，小分子毒素，连接子的检测表征需求外，还有特有的DAR值测定和分布，连接位点的确认，小分子毒素是否与连接子断裂等分析需求。赛默飞领先的色谱质谱技术，帮助您更好的确定药物的真实情况，助力您在这个领域领先一步。

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多种碎裂方式联合解析T-DM1小分子药物偶联位点
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简介：偶联位点的精确解析；T-DM1罗氏上市ADC药物

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工艺相关杂质主要来源于生产用物料，包括生产过程中使用的起始物料，生产过程中引入的原材料，制剂所用辅料以及直接接触药品的内包装材料的浸出物等。

1. 宿主细胞蛋白残留物


随着高分辨质谱技术性能的不断提升，已具有高灵敏度和宽的定量动态范围，以及蛋白质组学技术的飞速发展，可实现对未知蛋白质的高通量定性和定量。

采用赛默飞EASY nLC 1200与Orbitrap系列高分辨质谱仪联用，UPS2中含有48种内标蛋白6个不同浓度，共鉴定其中24种，其实际含量结果如下表，含量范围为0.05-444.88ppm，实际含量>1ng（10ppm）的16种内标蛋白全部鉴定到，实际含量在0.06-0.38ng（0.6-3.8ppm）范围内共鉴定到6种，此方案的灵敏度足以满足生物药领域客户的需求。

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牛血清白蛋白用于细胞培养，但它也是一种异种蛋白，残留量偏高的情况下，多次使用能引发机体的过敏反应。药典规定测定病毒类疫苗中残余牛血清白蛋白的含量，应不超过50ng/剂。

采用MabPac SEC体积排阻色谱柱结合生物惰性液相Vanquish对牛血清白蛋进行了直接测定，无需衍生，能有效排除小分子的干扰，可以排除无/弱紫外吸收大分子辅料干扰（如吐温、PEG等），适用于高盐和宽pH范围缓冲液，有效防止蛋白吸附。

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铝佐剂是最早使用的佐剂，也是目前唯一广泛使用的疫苗佐剂，铝佐剂具有便宜、安全、合成简单的优点，但也存在易在体内蓄积、可能刺激I gE 产生、无法生物降解等问题。在疫苗成品中需对铝含量进行检测，如13 价肺炎球菌结合疫苗中铝含量应为 0.15-0.35 mg/ml，吸附白喉疫苗中氢氧化铝不得高于0.3mg/ml。

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电荷异构体分析

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SCX-MA方法

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1）icIEF质谱在线联用，直接且快速地识别 PTM，包括可能影响生物治疗药物安全性和有效性的糖基化和电荷变异体。

2）高效且简便得组份分离后与传统LCMS结合深入表征电荷异构体，以研究您的生物治疗药物的效力、安全性和功效。

icIEF-Orbitrp方法

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使用 ProPac 3R 色谱柱进行蛋白类药物电荷变体分析

Thermo Scientific™ ProPac™ 3R系列阴离子交换色谱柱和阳离子交换柱，采用了单分散颗粒技术，对于比较难分离的双特异性抗体、ADC、融合蛋白等样品，在比较低的流速下比经典的ProPac系列和MAbPac 系列离子交换柱有更好的酸碱峰分离效果。既节约了分析时间，试剂成本，又提高了分离效率。在四元系统上，搭配Thermo Scientific CX-1 pH梯度缓冲液，可以实现快速盐梯度方法和pH梯度方法开发，可简化对主要产品和杂质进行高分离度分离的方法优化过程

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