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T 细胞增殖过程中的细胞培养质量控制
简介
由于越来越多的生物治疗药物成功应用于临床试验，人们也对免疫肿瘤研究产生了极大的兴趣。这些生物治疗药物有多种形式，包括嵌合抗原受体（CAR）T 细胞、检查点阻断抗体和 T 细胞介导的双特异性抗体。这些免疫治疗方法都提高了 T 淋巴细胞靶向杀伤癌细胞的能力。
研究和开发新的免疫疗法需要强有力的技术来纯化和培养 T 细胞。这里我们描述了从血液中分离 T 细胞后使用 Invitrogen Dynabeads 磁珠进行激活和扩增 T 细胞的方法，而不需要培养细胞或抗原。过度刺激 T 细胞可导致活化诱导的细胞死亡，细胞培养条件或技术的改变会影响 T 细胞的活性。
研究表明，T 细胞的活性越高，T 细胞的性能也越好。使用少量样本快速评估 T 细胞的健康状况是很重要的。Invitrogen Countess II FL 自动细胞计数器可以在细胞分离和激活前后，快速、准确地测定细胞活力和浓度，为实验节省时间和宝贵的细胞。此外，Invitrogen EVOS XL Core 成像系统可以用于监测 T 细胞的培养状态，而不影响激活过程，也不需要在培养箱外延长时间。
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材料
- EVOS XLCore 成像系统（货号：AMEX1000）
- Countess II FL 全自动细胞计数仪（货号：AMQAF1000）
- Invitrogen Countess 细胞计数仪玻片（货号：C10228）
- Invitrogen 台盼蓝染色试剂（0.4%）（货号：T10282）
- Gibco CTS OpTmizer T Cell Expansion SFMSFM（T 细胞扩增无血清培养基）（货号：A1048501）
- Gibco PBS（磷酸盐缓冲液），pH 7.4（货号：10010023）
- Invitrogen Dynabeads Untouched 人 T 细胞试剂盒（货号：11344D）
- Gibco Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28（货号：11131D）
- Invitrogen DynaMag-15 磁力架（货号：12301D）
方法
从全血中分离 T 细胞
将人外周血与等量 PBS（各 20 mL）混合，慢慢加入 15 mL Ficoll 分离液，400 x g 离心 30 分钟。分离外周血单核细胞（PBMC）层，并用 PBS 冲洗。分离的细胞与等体积的台盼蓝染色试剂（各 10 μL）混合，然后吸 10 μL 该混合液滴入 Countess 细胞计数仪的玻片上。（如图 1）用 Countess II FL 自动细胞计数仪检测细胞活力和浓度。然后用 PBS 将细胞稀释至 1×108个细胞/mL。
Figure 1. Loading a Countess chamber slide.
使用产品说明书中描述的 Dynabeads Untouched Human T Cells Kit 对 T 细胞进行阴性分离。简而言之，用提供的抗体混合物和 Depletion Dynabeads 磁珠去除 B 细胞、自然杀伤（NK）细胞、单核细胞、血小板、树突状细胞、粒细胞和红细胞，仅留下 T 细胞供下一步使用。
激活人 T 细胞
分离的 T 细胞在 Countess II FL 全自动细胞计数仪上测定细胞活力和浓度。细胞浓度稀释为 1 x 106个细胞/mL 后在 CTS OpTmizer T Cell Expansion SFM 培养基上扩增。Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 中磁珠与细胞的比例为 1:1。细胞置于 T-75 锥形中，然后放入 37℃、5% CO2的细胞培养箱中。
监测 T 细胞增殖过程和活力
每隔 24 小时，将锥形瓶从培养箱中取出，在 EVOS XL Core 成像系统上放大 40 倍观察。最初，观察到 T 细胞和磁珠沉降到锥形瓶底部。24 小时后，细胞和磁珠开始结合并形成团块，团块的大小随细胞的增殖而增大。细胞团块附着较弱，增殖 5 天后，细胞团块容易被上下管状介质破坏。当磁珠在培养瓶时，使用正常的细胞计数技术，可能很难测量出准确的细胞浓度。Countess 软件允许根据大小、亮度和圆度对细胞进行门控，能包含或排除碎片或特定的细胞群。增加阈值下限使仪器只计算较大的 T 细胞，而不计数较小的磁珠。
一旦完成增殖，磁珠和细胞在培养基中复苏，并转移到一个 15 mL 的锥形管。然后在 DynaMag-15 磁力架放置 2 分钟.在纯化过程中，被激活的 T 细胞与磁珠分离，置于培养基中用于后续实验。
结果
Dynabeads Untouched Human T Cells Kit 用于分离 T 细胞，分离的 T 细胞经 Countess II FL 全自动细胞计数仪（图 2）测定，活力为 95%。
然后用 Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 激活并扩增这些分离的 T 细胞。通过 EVOS XL Core 成像系统可以很容易地监控锥形瓶中的 T 细胞和磁珠，而不会干扰细胞及其激活过程（图 3 和图 4）。
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Figure 2. Viability and concentration of isolated T cells determined using the Countess II FL Automated Cell Counter. T cells isolated with the Dynabeads Untouched Human T Cells Kit were 95% viable.
Figure 2. Viability and concentration of isolated T cells determined using the Countess II FL Automated Cell Counter. T cells isolated with the Dynabeads Untouched Human T Cells Kit were 95% viable.
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Figure 3. Expansion of T cells with Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28. Every 24 hours, the flask containing isolated T cells and Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 was viewed on the EVOS XL Core Imaging System. Clumping of the beads was observed 1 day after activation, and the clumps increased in size as the T cells became activated and proliferated.
Figure 3. Expansion of T cells with Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28. Every 24 hours, the flask containing isolated T cells and Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 was viewed on the EVOS XL Core Imaging System. Clumping of the beads was observed 1 day after activation, and the clumps increased in size as the T cells became activated and proliferated.
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Figure 4. Isolation of activated T cells. (A) Image was taken immediately after cells were dispersed from clumps into a single-cell suspension with beads still present. (B) Image was taken after magnetic removal of beads when only activated T cells remained.
Figure 4. Isolation of activated T cells. (A) Image was taken immediately after cells were dispersed from clumps into a single-cell suspension with beads still present. (B) Image was taken after magnetic removal of beads when only activated T cells remained.
用 Countess II FL 全自动细胞计数仪测定激活 T 细胞的活力和浓度。利用仪器软件的门控特性（增大阈值）来排除磁珠对细胞计数的干扰。即使有磁珠存在，也可以测定激活 T 细胞的活力（图 5）。
结论
这个工作流程可以分离、激活和增殖健康的 T 细胞，用于下游的免疫肿瘤学应用，该研究在癌症治疗中迫切需求。
Countess II FL 全自动细胞计数仪无论是在初始分离和激活后，甚至当 Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 存在时，也能快速、准确地测量 T 细胞活力和浓度。这些关键过程中的监测有助于确定细胞是否健康，决定细胞是否继续增殖。Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 对生长在 CTS OpTmizer T Cell Expansion SFM 中的 T 细胞具有很强的激活作用。EVOS XL Core 成像系统可以快速检查 T 细胞增殖状况（通过细胞团块显示），而不会破坏细胞或延长在培养箱外的时间。这些试剂结合监测 T 细胞活化、增殖和活力的能力，以最小的细胞干扰，生产出高质量的 T 细胞，可用于免疫肿瘤实验，以帮助加快癌症治疗。
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Figure 5. Determination of cell viability and concentration in the presence of Dynabeads magnetic beads. (A) The Countess II FL Automated Cell Counter can determine cell concentration and viability even with beads present. (B) The size threshold on the software can be adjusted to exclude beads (faded colored bars) while still providing accurate measurements of cell viability and concentration.
Figure 5. Determination of cell viability and concentration in the presence of Dynabeads magnetic beads. (A) The Countess II FL Automated Cell Counter can determine cell concentration and viability even with beads present. (B) The size threshold on the software can be adjusted to exclude beads (faded colored bars) while still providing accurate measurements of cell viability and concentration.
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Ficoll 是 GE Heathcare 的注册商标。
仅供科研使用，不可用于诊断目的。