使用泛素-蛋白酶体途径降解蛋白质

蛋白质降解负责蛋白质稳态和细胞内蛋白质量控制。它也是由泛素-蛋白酶体途径 (UPP) 调节的众多细胞功能之一，以泛素标记蛋白质进行降解，将其运输到蛋白酶体以进行氨基酸的消化和循环利用。严格调节的蛋白质降解过程可防止未来细胞过程中错误折叠或功能失调的蛋白质，并将的蛋白质表达维持在适当水平以预防疾病。蛋白质降解也可用于识别疾病的治疗靶点，方法是使用小分子药物靶向特异性细胞蛋白质进行降解，这一过程称为靶向蛋白质降解。

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蛋白质更新是维持细胞稳态的重要生理过程，根据细胞需要不断降解和重新合成蛋白质。蛋白质降解发生可能基于多种因素，例如蛋白质的半衰期、外部刺激、特异性细胞信号或蛋白质功能失调。细胞利用自己的机制通过两个严格控制和调节的途径——溶酶体-蛋白酶体途径和泛素-蛋白酶体途径 (UPP) 来降解蛋白质和再利用氨基酸。2004 年，诺贝尔化学奖授予 Avram Hershko、Aaron Ciechanover 和 Irwin Rose，以表彰他们对发现泛素依赖性蛋白质降解的贡献。UPP 已成为调节多种细胞过程的关键途径，负责大多数细胞内蛋白质的蛋白质更新，进行功能失调和错误折叠蛋白质的降解，以维持细胞稳态和细胞存活 [1]。因此，了解蛋白质降解机制以及如何直接影响进入泛素-蛋白酶体途径的蛋白质对于确定药物开发的新靶点至关重要。

蛋白质中的缺陷，例如蛋白质错误折叠，可能是由基因突变、翻译错误、异常蛋白质修饰甚至应激引起的。蛋白质生产中的这些错误会导致多种疾病，并且已经发现人类疾病与蛋白质错误折叠之间存在着某些关联 [2]。例如，帕金森病是由蛋白质错误折叠引起的，具有路易小体聚集的病理特征，对其泛素染色亦呈阳性。识别和去除对生物学有害或仅有部分功能的蛋白质的缺陷也可能导致疾病。大且难以折叠的蛋白质——囊性纤维化跨膜传导调节因子 (CFTR) 中的突变可导致蛋白质被 UPP 标记且降解，表明CFTR具有生物学功能 [3]。因此，UPP 去除 CFTR 会导致与疾病囊性纤维化相关病理的发生。

鉴于 UPP 在日常细胞基本功能中发挥的巨大作用，从 DNA 转录调控、蛋白质合成和降解，到细胞周期和氨基酸再循环，该途径需要精确的调控和监测。UPP中通过泛素化和泛素化酶去除泛素控制的蛋白质表达提供了第二个检查点，作为编码蛋白质合成的遗传核苷酸的质量控制机制。这些细胞机制确保发生正确的蛋白质折叠并实现正常的蛋白质表达。了解蛋白质降解途径的工作原理、关键酶的具体作用以及如何控制这种自然发生的细胞过程（例如靶向蛋白质进行降解），将使研究人员能够创建更多临床相关的药理学靶点来治疗疾病。

泛素 (Ub) 是一种 8.6 kDa 的蛋白质，在真核生物中高度富集且普遍表达。泛素化描述了泛素分子与蛋白质的赖氨酸残基连接的过程。多个泛素分子的连接，称为多泛素化，标志着蛋白质降解到蛋白酶体。蛋白质泛素化是一种可逆的翻译后修饰，可调节各种细胞过程中的蛋白质更新 [4]。

蛋白酶体 (26S) 是一个 2.5 MDa 的多亚基络合物，其中发生蛋白质降解 [5]。该络合物由一个 20S 蛋白水解核心和一个 19S 络合物组成，其一端或两端具有三个不同的活性位点，可以降解各种底物，使其非常高效 [6]。这些活性位点包含在核心内，只允许未折叠的蛋白质进入，从而使蛋白酶体也具有高度特异性[5]。

细胞内蛋白质的泛素化涉及 UPP 中的三步酶促过程，该过程利用称为 E1、E2 和 E3 的酶。每种酶在降解的蛋白水解过程中都具有独特的作用（图 1）。

1. 泛素激活: E1 泛素激活酶在依赖 ATP 的两步反应中激活 Ub。
2. 泛素结合: E2 泛素结合酶与活化的泛素-E1 酶络合物结合，催化 Ub 从 E1 转移到 E2 的活性半胱氨酸位点。
3. 泛素连接: 最后，E3 泛素连接酶与靶蛋白的赖氨酸和 Ub 的 C 末端甘氨酸形成异肽键，形成单泛素-底物络合物 [7]。 

一旦用单个 Ub 分子标记，这就会向其他连接酶发出信号以将额外的 Ub 连接到蛋白质上。随后将 Ub 部分添加到该络合物中会导致形成多泛素链，该链可识别用于蛋白酶体 [8] 进行蛋白水解的蛋白质。然后多泛素化蛋白展开并通过 26S 蛋白酶体的 20S 核心。一旦蛋白质被确定为蛋白酶体降解，它就不能被逆转，从而确保部分降解的蛋白质不会用于正常的生物过程 [9]。这种蛋白质降解级联释放和再循环 Ub 以及来自蛋白质的氨基酸或肽，以供未来的细胞过程使用。

图 1.泛素-蛋白酶体途径。泛素在 ATP 依赖性反应中被 E1 酶激活。活化的泛素与特异性泛素结合酶 (E2) 结合，该络合物与泛素连接酶 (E3) 结合。然后，新的泛素-连接酶络合物与特异性靶蛋白结合，导致多泛素化。然后，多泛素化蛋白质被 26S 蛋白酶体识别并引导至 26S 蛋白酶体进行降解，再循环 Ub 和氨基酸以供细胞将来使用或重新启动其他蛋白质的 UPP。
 

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泛素的主要功能是调节蛋白质降解，为泛素通过UPP控制蛋白质表达提供了途径。泛素结合的翻译后修饰可以激活或失活蛋白质，以及调节蛋白质-蛋白质相互作用。泛素化是一个可逆过程，直到蛋白质变成多泛素化并注定要降解为止。蛋白质表达的调节由泛素连接酶与 Ub 的结合来调节，并被从蛋白质中去除泛素的酶（称为去泛素化酶 (DUB)）抵消。

DUB 是一个由 100 多种酶组成的庞大家族，它们通过从蛋白质中切割单泛素和多泛素链发挥重要作用 [10,11]。DUB 还切割单个 Ub 蛋白，这些蛋白可能与在 E1-E2-E3 级联过程中形成的小细胞亲核体融合，并且可以使特异性靶蛋白免于蛋白酶体的降解。DUB 通过酶促去泛素化靶向蛋白酶体或溶酶体降解的蛋白质，使它们负责再循环泛素以使其被细胞再利用 [12]。除了蛋白质降解外，DUB 还与多种生物过程相关，包括细胞生长和分化，以及通过组蛋白去泛素化和染色质稳定的转录调控。

尽管它们的作用尚未完全阐明，但最近已经证明，子宫内的几个 DUB的突变是发育障碍的原因 [13]。在癌症中，研究表明，由于DUB表达和活性增加导致的细胞蛋白质的去泛素化，使致癌基因稳定和表达上调，这些蛋白通常会被降解以抑制肿瘤生长[14]。需要进一步的工作来了解这个酶家族如何在遗传和蛋白质水平上发挥重要作用，特别是在病理状态下，以评估它们用作治疗靶点的潜力。

为了确定蛋白质是否被靶向降解，通常需要确定蛋白质是否已被泛素化。多种应用可用于评估蛋白质泛素化的上靶效应和脱靶效应。基于抗体的方法，例如蛋白质印迹、ELISA和蛋白质分离测定可以帮助评估细胞内翻译后修饰，例如多泛素化。然而，这些技术只能提供全局泛素表达水平，而无法确定特异性目标蛋白 (POI) 是否已被 Ub 标记。

为了更具体地确定您的 POI 是否已被泛素化，LanthaScreen Conjugation Assay Reagents提供灵敏的高通量筛选 (HTS) 试剂来监测泛素与 POI 的结合率，或结合程度.这些试剂盒可用于快速开发结合酶的筛选测定。

可以使用高结合亲和性树脂从细胞或组织裂解物中分离多泛素化蛋白质。泛素富集试剂盒可用于分离和分析细胞内多聚泛素修饰的蛋白质。树脂结合的蛋白质被洗脱出来，可以使用针对您的 POI 的抗体进行探测，以确认表达水平。

蛋白酶体抑制剂可用于细胞培养以积累泛素化状态的蛋白质。免疫共沉淀，即 co-IP, 可以揭示不同治疗方法的泛素化程度，并帮助评估您的 POI 的泛素表达。裂解物可以与目标特异性抗体一起孵育以下拉 POI，然后用抗泛素抗体进行蛋白质印迹以确定蛋白质-蛋白质相互作用。Thermo Fisher Scientific 提供了 100 多种与泛素信号传导相关的抗体，这些抗体在可用于研究蛋白质泛素化的各种应用（图 2）。

图 2.通过蛋白酶体抑制剂治疗增加全局泛素化。对用蛋白酶体抑制剂MG 132处理的 MCF7 和 Jurkat 细胞的全细胞提取物进行蛋白质分析。用小鼠抗泛素 B 单克隆抗体和山羊抗小鼠 IgG (H+L) superclonal 二抗探测蛋白质印迹膜，用于全局泛素化的化学发光检测。在两种细胞系中都观察到与泛素化蛋白相对应的谱带，用 MG 132 处理后泛素化增加。
 

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为了促进高通量、大规模定量蛋白质组学，可以使用串联质谱标签 (TMT)标记进行质谱分析。对于单细胞蛋白质降解水平，脉冲追踪分析可用于实时测量。Click-iT Plus 技术提供了一种用一系列荧光标记新生蛋白质的方法，并提供了使用脉冲追踪型实验对合成和降解进行时间研究的机会。

在许多情况下，重要的是确定蛋白质降解是否特定于 POI，或者细胞中的所有蛋白质是否都被降解。传统上使用放射性脉冲追踪实验来研究全局蛋白质降解的速率。在使用标记的蛋白质时信号随时间的损失也可以使用质谱法的荧光或 TMT 标记来量化，作为脉冲追踪方法的替代方法。然而，在病理条件下，很难确定单个蛋白质转化率的变化是否是蛋白质合成或降解改变的结果[15]。

Click-iT AHA Alexa Fluor 488 蛋白质合成 HCS 检测试剂盒、Click-iT HPG Alexa Fluor 488 蛋白质合成检测试剂盒和Click-iT Plus OPP Alexa Fluor 488 蛋白质合成检测试剂盒是使用高内涵荧光显微镜或流式细胞术检测新生蛋白质合成的灵敏且无放射性的替代品。传统 35S-蛋氨酸方法、化学选择性连接或“点击”反应试剂盒的替代方法是在活性合成过程中使用氨基酸上的生物正交（生物学上独特的）部分对蛋白质进行荧光标记。Click-iT Plus 检测试剂盒检测蛋白质翻译事件，同时能够保存细胞形态、荧光标记的鬼笔环肽的结合以及来自 GFP 的荧光信号。

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