3D 研究和应用资源

神经疾病的精确体外建模需要大脑的多种细胞类型相互作用并向成熟的功能发展。当人类多能干细胞 (PSC) 在 3-D 中进行神经分化时，子代细胞的自我组织化会形成有大脑样结构和功能的器官，这在 2-D 培养物中并未观察到。然而，不断增加的神经类器官复杂性通常伴随着低通量和低重现性。因此，用于药物发现的疾病模型可能必须通过对所需细胞类型的诱导特殊分化，调节自组织的复杂性。

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结果清楚地证明从 2D-NSC 培养系统过渡到 3D 的可行性以及优化几个关键培养系统参数的重要性，以便可重复地产生神经球状体，并影响成熟速率。在 2D 和 3D 细胞模型中定义神经生物学建模和分析的相对益处是一个有前景的研究领域，其中我们的研究着重考虑了几点。

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用于多能干细胞 (PSC) 扩增的培养系统能够产生几乎无限的细胞池，可用于下游分化、疾病建模、药物发现和治疗应用。虽然已经完善建立 PSC 的二维 (2D) 无饲养层扩增，但是能够使用传统方法有效制造的 PSC 以及随后的 PSC 衍生细胞类型，其规模有限，没有显著增加实验操作时间，并且存在潜在的污染风险。为了克服这一挑战，将 PSC 作为三维 (3D) 球状体在悬浮液中作为自组装聚集体进行扩增，从而获得大规模的细胞增殖。

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由于肝脏是大多数药物代谢的主要部位，因此确定肝脏中药物代谢酶的诱导是药物发现过程中的关键一步。人原代肝细胞 (PHH) 被认为是研究肝脏生物学、肝功能和药物诱导肝毒性体外模型的金标准。然而，在常规的 2D 单层培养物中生长的 PHH 在一周内迅速去分化并失去肝脏特异性功能。另一方面，最近开发的 3D球状体培养物模拟肝脏微环境并维持肝功能至少 5 周。因此，体外 3D 模型已被证明能够更准确地反映体内肝脏生物学。[1]在这项研究中，我们使用 Thermo Fisher 的 QuantiGene Plex Assay，在 PHH 样品的 3D 球状体培养物中研究与药物吸收、分布、代谢和排泄 (ADME) 相关的 57 基因以及管家基因。在用原型配体诱导前后，2D 和 3D PHH 培养物之间的ADME 基因表达有着显著不同。因此，3D PHH 培养物进行 Quantigene 分析可获得更全面的肝脏药物相互作用的表征。 

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人原代肝细胞 (PHH) 培养物可提供最接近人体肝脏的体外模型，该模型能够生成与体内非常相似的给药物的代谢特征谱。因此，PHH 培养是研究体外肝脏生物学、肝功能和药物诱导的肝毒性的金标准。常规的 2维 (2D) PHH 培养由于去分化和肝脏特定功能的迅速丧失而受到局限。因此，需要更强健的体外模型，用于反映培养寿命更长的体内肝脏生物学。近年来，肝细胞的体外 3维 (3D) 模型因其能够重现肝功能、延长寿命而备受关注。我们开发了一个易于组装的体外 PHH 3D 球状体模型。我们的初步工作表明，PHH 可在接种后 5 天内，使用 Nunclon Sphera 超低吸附表面 96孔 U 形底培养板和标准离心法组装成球状体。作为我们未来工作的一部分，我们正在研究将非实质肝细胞（如枯否细胞和星状细胞）引入球状体系统的可能性，以评估创建各种肝病模型的可行性。

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三维肿瘤球状体提供与完整生物体中的肿瘤微环境非常相似的生化条件。无创方法（如荧光显微镜技术）是非常有利的，因为其允许对这些 3D 系统进行研究。在本研究中，我们研究了自然杀伤细胞、细胞毒性 T 细胞和抗体药物偶联物在乳腺癌和肺癌三维模型中的渗透和效力

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药物研发和癌症研究人员依赖可重复的生物分析法，以指导药物化学项目。癌症研究领域的当前目标是探索并将微孔板检测仪和分析系统的使用扩展到抗癌研究中药物研发的 3D 细胞模型领域，特别是针对实体肿瘤建模，筛选化合物并确认其活性。在本研究中，我们使用不同的 HTS 检测方法筛选多种治疗药物，建立药物剂量反应曲线，提供更多的细胞活性检测方案。尽管缺乏 3 维细胞模型的研究指导方针和技术，我们使用现有细胞分析法，确定了疗法对 2D 和 3D 细胞模型的不同影响

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在此研究中，我们使用激光扫描共聚焦显微镜，通过测量亚衍射尺寸的荧光微球的点扩散函数 (PSF)，以证实在常规覆盖介质中折射率不匹配的有害影响。然后，我们将这些结果与 Invitrogen  ProLong  Glass Antifade Mountant 中制备的样品进行比较，其中该样品的最佳折射率为 1.52。我们的数据表明，在深度超过 20 µm 时，折射率不匹配的覆盖介质在轴向分辨率上的损失很大，而折射率匹配的覆盖介质始终保持最佳的轴向分辨率，在焦深为 100 µm 及以上时，轴向分辨率可提高 75%。通过消除不必要的折射，ProLong Glass Antifade Mountant 还可使到达物镜的光线最大化，从而在厚生物样品（如模拟肿瘤微环境的球状体培养物）成像时，提供更高的灵敏度和更亮的图像。ProLong Glass Antifade Mountant 与可见光和近红外光谱中的光漂白防护相结合，其优化折射率可显著提高任何 3D分析细胞或组织类型的保真度和图像质量，使其明亮、分辨率高

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药物开发中的高损耗率和位移相关性的缺乏可追溯到在进行目标识别、先导物识别和优化时缺乏生理相关性。虽然动物研究在生理学上相关性更高，但这既耗时又昂贵。因此，在基于细胞的体外分析和体内动物研究之间，为实验模型选择合适的细胞微环境。这些系统将模拟体内环境，同时重现简易的细胞分析操作。常规的二维细胞培养模型缺乏生理相关的环境条件。其整个物理和生化环境都完全不同。为此，研究人员已经转向三维类器官和肿瘤球状体系统。在这种系统中，细胞从细胞与细胞以及细胞与细胞外基质 (ECM) 的接触中获益。此外，这些细胞通过现有的 3D 系统形成梯度，以一种更具生化相关性的状态存在，主要是氧气、养分和代谢物。在三维模型中也存在功能不同的区域，在一个位置（通常在核心）可观察到细胞凋亡或坏死区域，而沿着外围可检测到增殖细胞区。这些条件与完整生物体细胞周围的宏观环境非常相似。无创方法，如荧光显微镜技术是非常有优势的，因为其允许对这些三维系统进行研究。我们描述了一套荧光生物传感器与自动荧光显微镜技术相结合的应用，以定量分析高通量的 3D 细胞模型。这些可量化球状体模型中的诱导细胞凋亡的数据将显示出来，其中结合了线粒体膜电位测量或用环境敏感荧光染料标记的治疗性抗体的隔离。其他相关细胞参数的评估，如生存力、增殖、细胞周期和活性氧 (ROS) 的产生将在 3D 细胞模型中进行演示。最后，将显示激活免疫细胞渗入肿瘤球状体模型的活细胞分析。

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最新证据表明，3维 (3D) 肝球状体中培养的原代肝细胞在延长寿命和增加肝脏代谢模型的生理相关性方面具有主要优势。赛默飞世尔科技的狗（比格犬）、小鼠 (CD-1) 和大鼠 (Sprague Dawley) 的肝细胞用于球状体鉴定。3D 肝球状体在 1-4 周内进行了表征，其中评估了以下因素：细胞活力（如通过三磷酸腺苷 (ATP) 合成所示）、白蛋白生成、第一阶段的代谢活性和基因表达。我们的数据表明，狗和啮齿类动物的原代肝细胞在第 5 天形成了 3D 球状体，而且在 4 周内都具有活力和功能。总之，我们的数据表明，与常规的 2D 细胞培养相比，3D 动物球状体培养是一种准确、可持续的肝细胞功能体外模型，能在更长的时间内维持肝功能

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越来越多的证据表明，与常规的二维单层培养相比，3维 (3D) 球状体细胞培养显示出更多的体内细胞类似的特性，这强调了其作为更具生理学相关性的体外培养系统的潜力。人肝细胞系 HepaRG 是研究药物代谢和毒性的成熟模型，已有大量报告表明其可用作 3D 细胞模型。然而，这些研究主要概括了基于细胞色素 P450 (CYP) 酶的动态时间代谢谱的标准单层（即 2D 培养）工作流程，从而在 3D 球状体中培养细胞。由于基因表达谱和细胞行为在 2D 和 3D 培养物中经常不同，我们假设常用的 HepaRG 球状体培养方案尚未得到优化。为了解决这个问题，我们比较了 HepaRG 2D 和 3D 培养物中，基础 CYP3A4 活性的时间分布，以确定细胞在这两种培养方式中是否有不同的功能。HepaRG 单层生长在 I 型胶原包被板上；在 Nunclon Sphera 的 96孔 U 形底培养板上形成了 3D 球状体。连续 10 天每隔 24 小时测量一次 2D 和 3D 培养物中的基础 CYP3A4 活性，并将其标准化为细胞活力。与公布的数据一致，我们的 HepaRG 培养物在培养的第 2-3 天形成了球状体，球状体大小与接种细胞数量成正比。初步数据证实，在培养的第一个 24 小时，2D HepaRG 培养物具有较高的 CYP3A4 活性，随后活性降低，在培养的第 6 天，活性缓慢恢复到峰值水平。有趣的是，与 2D 培养物相比，这些球状体培养物每天的基础 CYP3A4 活性明显更高（约 为 200 倍）。在球状体培养的聚合阶段（即第 1-2天），CYP3A4 活性升高，并在球状体完全形成的第 3天达到峰值。从第 3-10 天开始，HepaRG 球状体显示出相对稳定的 CYP3A4 活性水平。总之，这些结果表明，通常研究的代谢酶的时间分布在 HepaRG 单层培养物和球状体培养物之间是不同的。此外，HepaRG 球状体峰值活性水平的差异表明，球状体培养方法为实验设计提供更大的灵活性，培养时间可能更短。

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人原代肝细胞 (PHH) 培养提供最接近人体肝脏的体外模型，该模型能够生成与体内非常相似的给定药物的代谢特征谱。因此，PHH 培养是研究体外肝脏生物学、肝功能和药物诱导的肝毒性的金标准。PHH 2维 (2D) 培养的常规方法有很大的缺陷。PHH 在一周内迅速去分化并失去肝脏的特定功能。因此，需要更强健的体外模型，才能更准确地反映体内肝脏生物学，并更长时间地维持肝脏功能。体外肝脏 3 维 (3D) 模型因其能够重述肝功能和延长寿命而备受关注。最近，我们开发了一个易于构建、操作简单的体外人原代肝细胞 (PHH) 3D 球状体模型。3D 肝球状体在培养物中至少可存活 4 周，并保持表型稳定，从而保留肝细胞特定功能。

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在2 维 (2D) 单层中培养人原代肝细胞 (PHH) 的常规方法在肝脏生物学、肝功能和药物诱导的肝毒性研究中存在局限性。常规的2 维肝细胞培养物去分化后，导致在大约 5 天内丧失了特定的肝功能。我们已经开发并鉴定了一个 PHH 3 维 (3D) 球状体培养系统，该系统可保护肝功能并延长培养物寿命。使用 Thermo Scientific 的 Nunclon Sphera 低吸附表面 96 孔 U 形底微量培养板、Gibco 平板培养基和平板补充剂，Gibco PHH 可在 5 天内轻松构建成 3 维球状体培养物。与 2 维培养相比，球状体肝细胞 3 维培养需要的细胞数量明显更少，因此该系统能够更好地支持高通量检测。此外，在 3 维球状体培养物中的 PHH 至少在 3 周内具有活性功能，从而能够进行肝细胞功能的长期研究。

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我们开发了一个易于构建的体外人原代肝细胞 (PHH) 3D 球状体模型。在之前发布的应用指南中，我们能够证明 PHH 3D 球状体培养是一种强健的体外模型，可在培养物中存活 21 天，相对于 2D 培养，更能改善肝功能。为了证明这一点，我们分析了在人肝细胞功能中起作用的各种基因的表达水平，包括 3 维肝球状体培养中的 ABC 转运蛋白和第 1 阶段 P450 酶，结果显示，与 2 维肝细胞培养物相比，PHH 3 维培养物能更有效地表达肝基因。

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Thermo Fisher Scientific 开发的人原代肝细胞 (PHH) 三维 (3D) 培养模型为疾病建模和功能研究带来了希望。由于肝脏是大多数药物代谢的主要器官，原代肝细胞已成为评价肝脏药物代谢最常用的体外工具。然而，使用 3 维肝球状体对药物代谢进行评估的效率是相对未知的。3 维肝细胞培养和常规的 2 维肝细胞培养的一个主要区别是每孔的细胞数不同。单个肝球状体通常由 1000 至 3000 个细胞组成，而在常规的 2 维培养中，每孔有 50000（96 孔板）至 400000（24 孔板）个细胞。因此，可以预料的情况是，在 3 维培养中合成的代谢物浓度将低于 2 维培养。然而，我们观察到，与 2 维肝球状体相比，某些细胞色素 P450 (CYP) 酶的相对基因表达水平在 3 维肝球状体内更高。由于 CYP 蛋白是药物代谢第一阶段的关键酶素，我们通过高分辨率质谱法，测量了不同底物的 6 种不同酶素的 CYP 活性，直接比较了 2 维和 3 维培养物的活性。我们的数据证明了 Gibco 3 D 肝球状体模型在研究药物代谢中的效用。

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细胞培养技术的最新发展专注于创建 3维 (3D) 系统，试图展现体内细胞与细胞的关系和体外的微环境。3 D 培养物生成已经成功使用了各种组织工程技术，如生物打印、微流控技术和器官芯片技术。利用成体干细胞和多能干细胞（ASC 和 PSC）生成 3 维器官样（即类器官）细胞模型也取得了显著进展。基于 PSC 的方法通常始于在悬浮培养中聚集细胞，以形成称为胚胎体 (EB) 的细胞群。这些细胞群中的细胞能够分化成多种类型，经历自组织和自形态形成，以创建一个复杂细胞模型，更好地模拟给定组织类型的体内细胞-细胞相互作用和显微解剖。部分基于 PSC 的方法也需要将细胞包覆在天然或合成的细胞外基质 (ECM) 样底物中。在所有方法中，生长因子、小分子和其他培养基补充剂用于指导基于胚胎发生和成体干细胞生物学研究推断的原理的类器官系统形成。此处为许多已公开的方法

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