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在进行分子克隆实验时,您已经努力克隆了自己的目标 DNA 片段——完成了酶切、片段制备和目标插入片段纯化、载体和插入片段连接、细菌转化以及转化菌落的接种。但是当您筛选插入片段时,您却发现有些问题阻碍了您的实验进展。
你会怎么做?首先,反向追踪实验流程,检查每一步中可能发生的所有问题。如果每一步都按照分子克隆实验指南使用合适的对照,将使问题排除变得更快和更简单。
可能原因 | 建议 |
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细胞接种步骤 | |
细胞量不足 |
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抗生素使用错误 |
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抗生素浓度过高 |
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细菌转化步骤 | |
转化效率低 |
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插入片段有毒性 |
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转化混合物中的连接酶过多 |
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连接步骤 | |
连接效率低 |
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DNA 质量差 |
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转化混合物中的连接酶过多 |
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连接中存在不兼容末端 |
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片段制备步骤 | |
缺少 5′ 磷酸基团 |
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平端克隆效果不佳 |
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紫外线损伤DNA |
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限制性酶切步骤 | |
酶切效果不理想或酶切不完全 |
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可能原因 | 建议 |
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细菌转化步骤 | |
插入片段对细胞有毒性 |
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片段制备(去磷酸化)步骤 | |
载体自连 |
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限制性酶切步骤 | |
不完全酶切 |
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可能原因 | 建议 |
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细菌接种步骤 | |
抗生素浓度过低 |
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抗生素降解 |
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卫星菌落 |
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细胞密度过高 |
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细菌转化步骤 | |
耐抗生素的大肠杆菌菌株 |
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质粒重组至染色体内 |
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可能原因 | 建议 |
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细菌转化步骤 | |
插入片段不稳定 |
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片段制备步骤 | |
纯化提取条带错误 |
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限制性酶切步骤 | |
酶切效果不理想 |
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可能原因 | 建议 |
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细菌转化步骤 | |
插入片段突变 |
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片段制备步骤 | |
紫外线损伤DNA |
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仅供科研使用,不可用于诊断目的。