PCR/qPCR耗材选择注意事项——4个主要因素

PCR/qPCR耗材通常由聚丙烯制成，因为它是惰性的并且能够承受热循环过程中温度的快速变化。 聚丙烯的惰性性质使其对于反应物质的吸收降低至最小，确保获取最佳的PCR结果。为了进一步保障在纯度和生物兼容性方面的批次间一致性，应当在生产过程中使用全新未循环使用的医学级或分子生物学级高品质聚丙烯原料。请注意，某些PCR / qPCR板边框用更强的聚碳酸酯制成，以与高通量机器人应用兼容。

PCR管和板通常可提供多种不同的颜色形式，以便于对于样品的视觉区分和鉴别，特别是在高通量实验中。尽管塑料的颜色对DNA扩增没有影响，但在设置实时PCR或qPCR的反应时，与透明耗材相比，我们更推荐使用白色塑料或磨砂耗材，以实现灵敏和准确的荧光检测（图43）。

白色耗材通过阻止荧光折射出管（ 图2A）来提高qPCR数据的灵敏度和一致性。折射被最小化时，更多的信号被反射回检测器，从而增加信噪比（图2B）。此外，白色管壁可阻止荧光信号传递至PCR仪模块，避免被吸收或不一致地反射荧光信号，从而使重复实验（图1B）中的差异降至最低。由于每个品牌仪器的设计不同，请遵循厂家建议以获得最佳性能。比如，对于Bio-Rad和Roche品牌的定量仪器，推荐使用白色耗材用于qPCR。而对于Applied Biosystems荧光定量PCR仪，推荐使用磨砂孔耗材。

请注意，应使用超透明的管盖或光学密封膜来密封qPCR管和反应板，以提高灵敏度并降低可变性，因为它们专门设计为允许荧光信号通过,信号没有干扰。

最佳

为了避免可干扰DNA扩增的污染，PCR/qPCR塑料耗材应不含核酸酶和DNA的污染。尽管如高压和辐射等灭菌方法可去除细菌和DNA酶，但这些方法并不能去除灰尘和DNA残留。残留的灰尘客户可能会抑制PCR，而片段化的DNA依然可作为模板从而产生非特异性的扩增。

因此，在生产这些塑料耗材时，从制模到最终的包装都必须在具有颗粒数量限制的设施环境中进行。例如，100,000级洁净室允许在立方英尺空气中不超过100,000个直径≥0.5μm的颗粒。 这些类型的设施符合国际标准化组织（如ISO 9001 ）规定的严格指导原则，以防止灰尘和生物污染。

为了确保质量，生产商可能需要对PCR/qPCR塑料耗材进行视觉或物理检验其完整性，以确保对于反应成分保护。可以执行物理测试来评估样品孔的蒸发，密封和电连续性以检查泄漏。对于生物测试，塑料耗材会进行某些DNA目标分子的qPCR扩增，以评估核酸酶和人类DNA的污染。生产商对于经历过这些严格检验的PCR/qPCR塑料耗材可提供相应的检测报告书。

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PCR/qPCR塑料耗材可提供多种规格和形式。了解他们相应的特点和相关术语将会帮助您在使用这些塑料耗材时获得最佳的PCR和qPCR结果。

PCR/qPCR塑料耗材的加样体积决定了可成功进行的PCR/qPCR反应的规模（体积）。过量的加样将会导致热传导的效率下降，溢出以及交叉污染。另一方面，加样不足则会导致样品因蒸发而损耗。加热模块也决定了可使用的塑料耗材尺寸以及它们对于完整而有效热传导的最佳适配性。PCR/qPCR耗材的最常见体积规格为：

• 管：0.5 mL, 0.2 mL, 0.1 mL
• 96 孔板：0.2 mL, 0.1 mL
• 384 孔板：0.02 mL

PCR/qPCR容器的外形是指其高度，因此“low profile（低容）”意味着高度更低（图3）。 低容耗材更短的设计最大程度减少了反应体系上方的空间，降低了蒸发的影响并提高了热传导效率。因此，推荐优先选择低容耗材。通常对于加热模块来说，需要使用低容耗材，因此也被称为“快速”管或板。

具有均一薄壁的PCR/qPCR塑料耗材将会为反应的样品提供一致的热传导。超薄壁塑料比标准版薄约50％，进一步减少了热障，从而带来更快，更稳健的反应。 

用于qPCR的封板膜和管盖需要具有高度的光学透性，确保最佳的荧光信号传递和最少的失真。请注意，白色管被推荐用于改善qPCR数据，正如上文所述。

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对于低到中通量的PCR/qPCR实验，反应管是比较理想的选择。单个管和联管是两种最常用的形式（图4）。

• 单管提供了设置准确运行反应数量的灵活性。另外，反应体积更大时，可选择0.5 mL规格的单管。
• 联管通常以8或12管形式，管盖分开或带有管盖。可兼容单通道和多通道移液器，适用于低通量和中通量实验。带有管盖的联管可独立打开和关闭样品管，以防止样品污染。

为获得高效PCR，某些PCR仪热盖压力强大，因此可能需要使用特殊的托盘/支架来防止管子和联管被压碎。 

PCR / qPCR板通常采用96孔和384孔的形式，其次为 24孔和48孔（另见可分割耗材）。使用的PCR仪和正在进行的应用的性质将决定PCR / qPCR板是否适合您的实验（另请参阅我们的塑料选择指南）。

PCR / qPCR板的“裙”是板周围的板（图5）。裙边可为反应体系构建时的移液过程提供较好的稳定性，以及在进行自动机械处理时提供更好的机械强度。PCR / qPCR平板可分为无裙边，半裙边和全裙边。

• 无裙边板缺少周围的面板（图5A）。这种形式的反应板可与绝大多数PCR仪和实时PCR仪的模块适配，但不适用于自动化应用。
• 半裙边板在板的边缘周围具有短的边缘（图5B），在移液过程中提供足够的支撑并且为机器人处理提供机械强度。
• 全裙边的 PCR / qPCR板具有覆盖板高度的边缘面板（图5C）。这种板形式适用于具有突出模块的PCR仪（可有利于自动化操作），可安全稳固适配。全裙边还增强了机械强度，使其非常适合在自动化工作流程中使用机器人平台。

板的板面是指其上表面（图6）。

• 平面板设计适用大多数PCR仪，便于密封和处理。
• 凸面板设计对于某些PCR仪器的最佳适配和性能是必需的，有助于在不需要适配器的情况下平衡热盖压力。

切角是对PCR/qPCR板的一个角缺失，取决于所需要适配的仪器。切角可能位于96孔板的H1，H12或A12位置，或384孔板的A24位置（图7 ）。

为了兼容不同的机器人液体处理高通量系统，PCR/qPCR板应符合美国国家标准协会（ANSI ）和生物分子科学学会（SBS，现属实验室自动化和筛选协会（ SLAS））。符合ANSI/SBS的板具有标准的尺寸，高度，孔位置等，因而有助于于自动化处理。

PCR / qPCR平板（图8）的共同特点是在孔周围有一个凸起的边缘。该设计可有助于用封板膜进行密封以防止蒸发。

PCR/qPCR板上的字母数字标记将有助于识别单个孔及对应样品的位置。通常以白色或黑色打印凸起的字母，以便于查看（图9A）。然而，在自动化流程中凸起的标记可能会干扰到密封的过程。对于自动化应用，刻字（图9B ）可以改善板的外边缘的密封性。

某些96孔PCR/qPCR板被设计成可分割的。该设计使得一整块96孔板可以轻松被分割成更小的板，在不需要使用一整块板时可减少耗材的浪费并降低成本。具有24孔分割的平板是最常见的，但 32孔和 8孔分割也可以提供方便和灵活性（图10）。

在高通量实验（图11 ）中，半裙边和全裙边的PCR/qPCR板可以标记条形码，以便于记录和跟踪。为了更为安全可靠地追踪，条形码标记应当不能被刮掉并能承受化学侵蚀和一定的温度范围（如–196°C至120°C）。条形码阅读器的位置可能因自动化平台而异，在这些情况下，4边条形码或自定义条码是替代解决方案。

最常见的两种PCR密封方式是联排管盖和粘性封板膜。联管盖可用于密封PCR /qPCR联管和板，而粘性封板膜用于密封PCR / qPCR板（表1）。为了获得灵敏和可靠的qPCR数据，用于qPCR的管盖和封板膜应具有相同厚度和透明度的光学特性。

表 1.PCR/qPCR密封管盖和封板膜

请注意管盖和封板膜必须将管和板进行完全的密封以防止在热循环中发生样品的蒸发。诸如使用封膜刮板和按盖工具等工具实现紧密的密封。

连盖是用于密封联管和96孔板最常见的PCR / qPCR管盖形式（图12）。除了适配性外，透光度和形状也是在选择管盖时需要考虑的两个主要方面。

• 虽然管盖的透明度对DNA扩增没有影响，但超透明或光学盖对于在qPCR实验中收集可靠数据非常重要。
• 管盖的顶部可能是平顶（flat）或圆顶(domed)的。如何选择取决于所使用的PCR仪热盖设计。
  • 如果盖子具有稍微凹入的内表面以防止管子变形，则圆顶盖有助于确保适配以获得更好的PCR结果，同时充当压力吸收器以保持管子的完整性。
  • 平盖为书写标记提供了一个表面，设计用于带有平盖的PCR仪。 用于qPCR检测的光学管盖通常是平顶的，以实现荧光信号的高保真传递。

用于PCR板的密封膜可以由透明塑料或铝箔制成，每种都提供独特的优点（图13）。

• 粘性透明薄膜可能有一个不粘的表面，只有在对它们施加了足够的压力后才能密封这些孔，从而允许重新密封这些板并在必要时留下清晰的孔以获得最大的荧光传输。qPCR薄板必须具有高光学透光度，以尽量减少对数据采集的影响。如果是在进行人类身份鉴定等敏感的qPCR应用，确保相应的封板膜在生产时经过环氧乙烷处理（ISO18385要求）以去除潜在的DNA污染物以及可能产生的假阳性扩增。
• 尽管不适用于qPCR，但粘性铝膜对于光敏样品是理想的，由于可穿刺，便于PCR中样品转移。

特殊设计的透明薄膜或铝箔可使用热封仪进行密封，以确保在长期储存和/或运输过程中防止样品蒸发。

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PCR/qPCR检测的实验通量可能决定了该使用哪种类型的塑料耗材以获取最佳的处理效果。对于低到中等通量的应用，管通常更适合，而对于中高通量实验反应板更为理想。有些反应板设计时考虑到通量的灵活性，例如可分割成单条联排管条（了解更多信息：可分割板）。

对于高通量自动化，由于需要通过自动化系统的“抓手”或机械臂处理反应板，因此裙边和材质成分是需要考虑的两个最重要的方面 图14A）。

• 半裙边板和全裙板为机械抓手提供了必要的侧面，而非裙板不适合自动化（了解更多信息：裙边）。
• 尽管具有一定的耐久性，标准PCR板的聚丙烯材质尚不能承受机械臂所带来的夹力。发生扭曲的板将会影响自动化处理并干扰下游数据的收集。因此，用于自动化的PCR/qPCR板边框应该用更强的聚碳酸酯来构造，以抵抗机器人抓手造成的变形，并更好地承受快速加热和冷却。为了有效地将热量传递至反应混合物（图14B ），这些孔仍应该是薄壁聚丙烯孔。

请注意，多种颜色的框架便于高通量环境下实验室检测的组织和可视化监测。

总之，作为PCR体系构建的重要组成部分，塑料耗材对于实验以及数据收集的成功至关重要，特别是在中高通量的工作流程应用中。了解PCR/qPCR塑料耗材的基本信息将会有助于您作出正确的选择并获取最佳的PCR和qPCR结果。

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