PCR的技术原理

聚合酶链式反应,又称为PCR,是众所周知的分子生物学技术之一。20世纪70年代,研究人员首次报道了使用合成引物和DNA聚合酶从模板复制单链DNA[1,2]。然而,直到1983年,Kary Mullis才发明出用于扩增目标DNA的研究工具,就是我们今天所熟知的PCR方法[3,4]。从此以后,PCR成为分子生物学研究必不可少的一部分,被广泛应用于基础研究、疾病诊断、农业检测和法医调查等领域。而Kary Mullis也因这一发明获得了1993年的诺贝尔化学奖。

PCR

PCR是一种能够在短时间内将单个DNA分子扩增数百万倍的生化过程。其扩增过程包括三个连续步骤:(1) 变性,对双链DNA模板进行加热,使其解离;(2) 退火,被称为引物的短DNA分子与目标DNA的侧翼区域结合;(3) 延伸,DNA聚合酶沿着模板链将引物3’端进行延伸。将这些步骤重复(“循环”)25-35次,即可按指数方式获得精确的目标DNA拷贝(图1)。

多年以来,PCR的基本原理一直未变,但随着 DNA聚合酶 和试剂性能的大幅提升,以及 仪器塑料 耗材 的不断创新,PCR实验方法也在不断改进。

图 1.PCR的三个步骤——变性、退火和延伸——如第一个循环所示,目标DNA随重复循环而发生指数扩增。
 

DNA聚合酶

DNA聚合酶是PCR的重要组成部分,它们能够从单链DNA模板合成新的互补链。所有DNA聚合酶都具有 5′→ 3′ 聚合酶活性,即掺入核苷酸并使引物从按5'至3’方向延伸(图 2)。

早期的PCR,通常使用来源于 大肠杆菌 的DNA聚合酶I上的 Klenow片段 来生成新的子链[3]。但是,这种 大肠杆菌酶对热敏感,易受到变性阶段高温度的破坏,从而无法继续进行退火和延伸步骤。因此,需要在全程每个循环的退火步骤中重新补充酶。

热稳定DNA聚合酶的发现是一项重大进步。它实现了长时间的反应稳定性,为PCR方法的改进提供了无限可能。1976年,从耐热菌 Thermus aquaticus 中分离出来的Taq DNA 聚合酶是最有名的热稳定DNA聚合酶之一 [5,6]。1988年研究人员首次报道,证明 Taq DNA 聚合酶能够在 75°C以上保持活性,从而无需手动加入新鲜的酶即可持续循环扩增,实现了工作流程自动化。此外,与 大肠杆菌 DNA聚合酶相比, Taq DNA 聚合酶能够获得更长的PCR扩增子,并且具有更高的灵敏度、特异性和得率。也因此, Taq DNA 聚合酶被 《科学》 杂志评为1989年的“年度分子”[8]。

尽管 Taq DNA 聚合酶大大改善了PCR实验方法,但也表现出一些缺点。例如,TaqDNA 聚合酶在90°C以上的DNA链变性温度中相对不稳定。对于需要更高解离温度的富含GC和/或具有强二级结构的DNA模板而言,这一问题尤为明显。同时, Taq DNA 酶还缺乏校正活性,会在扩增期间引入错误核苷酸。对于克隆和测序而言,序列的准确性至关重要,所以不能存在含有错配的PCR扩增子。此外, Taq DNA 聚合酶的易错配特性使其通常无法稳定扩增长度大于5 kb的片段。为克服这些缺点,性能更好的DNA聚合酶不断被开发出来,使PCR在广泛的生物学应用中发挥其强大的功能(了解关于 DNA 聚合酶特点的更多信息)。

图 2:DNA聚合酶沿5′至3′方向使PCR引物延伸。

热循环仪

热循环仪是一种能够为PCR反应自动完成温度循环和孵育的仪器。在引入热循环仪之前,PCR反应是一个费时费力的过程,需在不同温度的水浴之间转移样品,并为每个步骤需要精确定时。热循环仪和 Taq DNA 聚合酶的发现,让PCR的自动化成为现实。第一款自动化PCR热循环仪是在1985年由PerkinElmer和Cetus以合资方式引入市场的[9]。此后, 热循环仪 的实用性、设计、温度控制和循环速度不断得到改善(图 3)。热循环仪也为 定量PCR仪 的开发开拓了道路,定量PCR仪将PCR扩增和PCR产物累积的实时检测结合在一起(了解关于 定量PCR的更多信息)。

热循环仪的历史发展动画

图 3.热循环仪的 历史 发展动画。

参考文献

专题视频

仅供科研使用,不可用于诊断目的。