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Western Blot总蛋白归一化试剂
总蛋白归一化
总蛋白归一化是获取准确的Western Blot定量数据的有效方法，因为看家蛋白通常会受到实验条件的影响。Invitrogen No-Stain 免染型蛋白标记试剂是一种快速、易用、共价的蛋白质标记试剂，适用于凝胶转印后的印迹膜，为Western Blot分析提供了灵敏、高线性度的总蛋白归一化工具。Invitrogen No-Stain 试剂也可用于在凝胶中对蛋白质进行快速、灵敏的凝胶染色。
No-Stain 免染型蛋白标记试剂
- 灵活的标记方式——可在转膜后，对膜上的总蛋白进行标记，对所用蛋白凝胶类型无限制。如果电泳后无需转膜，可以用它作为快速蛋白染料。
- 易于使用的方案——混匀后孵育印迹膜。反应时间为 10 分钟。凝胶染色也是 10 分钟的反应。
- 灵活的可视化方式——可使用带有 UV、绿色 LED 或荧光（约 488 mm）光源的多种成像仪，包括iBright FL1500 智能成像系统来捕获图像。
- 更准确的归一化工具——在更广的线性检测范围内，总蛋白归一化可提供更准确的定量结果：每孔上样 1–80 μg 总蛋白。
- 灵敏稳定的信号——可检测到低至 20 ng 以下的蛋白条带，该信号与下游抗体检测兼容。
演示视频
如何使用Invitrogen No-Stain蛋白标记试剂和iBright智能成像系统进行快速、简单和准确的定量Western Blot
这个演示视频为您展现如何使用No-Stain蛋白标记试剂快速、简单地标记印迹上的蛋白质。视频的后半部分逐步演示了如何在iBright智能成像系统上对western blot数据进行总蛋白归一化。
| 反应次数 | 标准试剂盒可以标记 40 块小型印迹膜或 40 块小型凝胶，或两者的组合。 |
| 反应时间 | 10 分钟 |
| 凝胶兼容性 | 兼容任意凝胶类型（预制或手灌胶）及凝胶体系（Bis-Tris, Tris-甘氨酸, Tris-乙酸, Tricine） |
| 膜兼容性 | PVDF、硝酸纤维素膜 |
| 免疫检测试剂兼容性 | 与化学发光或荧光检测的所有下游免疫检测步骤兼容 |
| 激发和发射波长 | 激发波长：约 488 nm（epi 蓝光）， 发射波长：590 nm |
| 检测灵敏度 | 20 ng/条带 |
| 线性范围 | 每个泳道上样 1–80 μg 总蛋白 |
| 对成像仪的要求 | 与具有紫外或荧光光源的各种成像仪兼容，例如 iBright FL1500 智能成像系统 |
| 工作原理 | No-Stain 免染型蛋白标记试剂与所有蛋白质上的赖氨酸侧链的一部分形成共价键。 |
| 试剂盒组成和存储条件 | No-Stain激活剂（800 μL； -20℃储存）； No-Stain衍生剂（800 μL； -20℃储存）； No-Stain 标记缓冲液，20X（每个 2 x 20 mL； 15-30℃储存） |
| 保质期 | 自制造之日起 1 年 |
使用No-Stain试剂在印迹膜上标记蛋白的方案
图1.转膜后，使用No-Stain蛋白标记试剂对蛋白印迹进行标记。
当蛋白转印至硝酸纤维素膜或PVDF膜后即刻处理：
用20mL水，在转速~60 rpm的摇床上漂洗印迹膜2分钟。重复漂洗步骤1次。
No-Stain蛋白标记试剂的工作液制备和印迹膜标记方法如下：
当蛋白转印至硝酸纤维素膜或PVDF膜后即刻处理：
用20mL水，在转速~60 rpm的摇床上漂洗印迹膜2分钟。重复漂洗步骤1次。
No-Stain蛋白标记试剂的工作液制备和印迹膜标记方法如下：
- 将0.5mL No-Stain标记缓冲液加入9.5mL水中，即稀释20倍，得到10mL 1X No-Stain缓冲液
- 将20 µL No-Stain活化剂加入1X No-Stain缓冲液中。
- 将20 µL No-Stain 衍生剂加入步骤2的混合液中。
- 将No-Stain蛋白标记试剂工作液加到漂洗好的印迹膜上，摇晃孵育10分钟。
在 Western Blot 中，不同的蛋白质样品浓度、不一致的上样量、转印过程中的误差都会引起不同的结果。蛋白质归一化用于校正这种差异，是获得可靠且可重复的Western Blot定量 数据的关键步骤。蛋白质归一化的方法包括使用看家蛋白为内参，如 GAPDH、β-tubulin、β-actin 或 cyclophilin B，外源性上样对照或总蛋白为内参的归一化。
近年来，期刊编辑和审稿人一直要求采用可提高Western Blot定量数据准确性和重现性的方法。许多主流期刊已经制定了提交 WB 研究的标准指南，指南中的相关引文展示如下。
- “为了进行定量比较，应使用适当的试剂、参照物和使得信号在线性范围内的成像方法”——Nature
- “记录如何获得数据，信号强度是否与抗原上样量呈线性关系，以及蛋白质加量如何归一化。”——Journal of Biological Chemistry
- “尽可能使用总蛋白上样量进行信号强度的归一化（通过膜染色对总蛋白进行评估）”——Journal of Biological Chemistry
- “在没有证据表明实验操作不会影响表达的情况下，看家蛋白不应用于归一化。”——Journal of Biological Chemistry
使用看家蛋白也会有缺点，因为看家基因的蛋白表达会随着实验条件的变化而变化，而且它们通常容易造成Western Blot信号的过饱和。
使用 No-Stain 免染型蛋白标记试剂的总蛋白归一化可避免使用看家蛋白进行归一化的差异性和不准确性，并节省了使用免疫印迹法检测看家基因蛋白表达的时间、精力和成本，包括可能涉及的印迹剥离和重新检测。
一个准确的内参应在所有实验条件下，都体现信号强度和样品量之间的线性关系。通过使用No-Stain试剂标记膜上总蛋白获得的信号强度，就可在所有实验条件下，都确保与样品量呈线性关系（图 2）。因此，在定量Western Blot应用中，No-Stain 试剂可实现使用总蛋白作为理想内参。
No-Stain 试剂和看家蛋白的线性度比较
图 2 中的图表显示了使用 No-Stain 免染型蛋白标记试剂进行总蛋白归一化时，信号响应与每孔蛋白上样量的线性关系。来自看家蛋白的信号则在较高的裂解物上样量下饱和，带来了不准确的归一化结果。
图 2.使用 No-Stain 免染型蛋白标记试剂进行总蛋白归一化在Bolt 4-12% Bis-Tris Plus 预制胶中加入 10 至 50 μg 的 Hela 裂解物，并使用 MES电泳缓冲液进行电泳。使用 iBlot 2干转系统和iBlot 2 小型PVDF转印膜组（7 分钟方案），将凝胶中的蛋白质转移到 PVDF 膜上。在旋转平台上用 20 mL 的超纯水将 PVDF 膜漂洗两次，每次 2 分钟，然后用 10 mL 的 No-Stain 标记溶液摇动标记 10 分钟。接下来，在旋转平台上用 20 mL 的超纯水洗膜 3 次，每次 2 分钟，使用β-actin（货号 AM4302）、GAPDH（货号 398600）和 α-tubulin（产品编号 138000）一抗孵育印迹膜，然后加入山羊抗小鼠 Alexa Fluor Plus 680荧光二抗（货号 A21058）。使用 iBright 成像仪进行印迹成像。通过iBright 软件来定量泳道中的总蛋白信号。对使用 No-Stain试剂标记的整体上样区域的标绘数据进行线性回归值的测定（R2 = 0.9990），而 β-actin、GAPDH、和 α-tubulin 的 R2 值分别为 0.8851、0.9438 和 0.8332。
下面的图 3 显示了转印后采用 No-Stain 试剂标记蛋白所得的信号与蛋白上样量是成比例的线性关系。
图 3.膜上 No-Stain 标记的蛋白信号响应是线性的。在Bolt 4-12% Bis-Tris Plus 小型预制胶中，加入1 到 50 µg HeLa 裂解物，PageRuler 预染蛋白 marker 在第 1 道。使用 MES电泳缓冲液进行电泳后，使用 Invitrogen Power Blotter 和 Power Blotter 即用型转印膜组将蛋白质转移到 PVDF 膜上（10 分钟）。在旋转平台上用 20 mL 的超纯水漂洗 PVDF 膜两次，每次持续 2 分钟。在放有 PVDF 膜的皿中加入 10 mL No-Stain 标记溶液，开始 No-Stain 标记反应。在旋转平台上进行标记反应 10 分钟。然后在旋转平台上用 20 mL 的超纯水漂洗膜 3 次，每次持续 2 分钟。在iBright成像系统上使用No-Stain印迹膜epi模式（455-485 nm 激发光和 565-615 发射光）捕获图像
下面的图 4 是在硝酸纤维素膜上使用 No-Stain 蛋白标记试剂对目标蛋白进行归一化的实例。
图 4.使用 No-Stain 蛋白标记试剂和 iBright 成像系统进行定量 WB 分析。将 Novex 4-12% Tris-Glycine 楔形孔预制胶，加入表达 RB1 的 HeLa 细胞裂解物后电泳，总蛋白上样量为 0.6～10 μg。凝胶中的蛋白质使用 iBlot 2 干式转印系统转移到硝酸纤维素膜上。用 No-Stain 蛋白标记试剂标记硝酸纤维素膜 10 分钟，用 iBright 成像系统对标记的膜进行成像。在这张经过 No-Stain 标记的膜上，用 Alexa Fluor 645 标记抗体检测 RB1。用 iBright 归一化软件去定量加入 0.6-10 μg HeLa 裂解物的通道中总蛋白信号强度和 RB1 免疫检测条带的信号强度。绘制总蛋白上样量和 RB1 的信号强度图。
用 No-Stain 免染型蛋白标记试剂标记凝胶中的蛋白质
No-Stain 蛋白标记试剂在 10 分钟内与凝胶中的所有蛋白质中的赖氨酸侧链部分形成共价键。
- 传统凝胶染色试剂的理想替代品——无需脱色，可在宽线性范围内对上样的蛋白质裂解物（1–80 μg）进行精确归一化。
- 灵敏度高——检测下限为每条带 20 ng。
- 特异性好——只与蛋白质的赖氨酸侧链形成化学键。未结合的标记试剂不会自发荧光，确保带来卓越的信噪比。
- 灵活兼容——与任何凝胶类型兼容，无需改变你所用的凝胶即可体验免染的便捷性。
定量凝胶染色
图 5展示了使用 No-Stain 蛋白标记试剂标记凝胶中的蛋白质时，信号与蛋白上样量之间的线性关系。
图 5.定量凝胶染色在Bolt 4-12% Bis-Tris Plus 小型预制胶中上样2.5-80 μg的HeLa 裂解物，加入 MES电泳缓冲液后进行电泳。电泳后，按照 No-Stain 蛋白标记试剂说明书中的实验方案，对凝胶中的蛋白质进行标记，凝胶用 iBright 成像系统成像，凝胶成像仪的激发波长（490-520 nm），发射光的滤光片为 565-615 nm。
No-Stain蛋白标记试剂兼容化学发光和荧光检测体系，因此，您可以继续使用目前的化学发光酶标二抗。因此，您可以使用目前化学发光的酶标二抗。在设计使用荧光抗体的实验体系时，选择不与 No-Stain 标记物的激发和发射光谱重叠的荧光基团是很重要的，当与赖氨酸残基共价结合时，No-Stain 在 488 nm 激发，在约 590 nm 发射。荧光基团的选择取决于你的荧光成像仪的滤光片组合。
你可以将荧光二抗的激发光谱和发射光谱与 No-Stain 标记物的激发光谱和发射光谱进行比较，以评估与当前荧光二抗的兼容性。共价连接的 No-Stain 标记物的激发和发射光谱如图 6 所示。
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图 6.共价连接的 No-Stain 标记物的激发光谱和发射光谱。共价连接的 No-Stain 标记物的激发最大值约为 488 nm，发射最大值为 590 nm。光谱分析表明，No-Stain 标记物的信号可以用紫外或荧光光源成像，信号可以用宽范围的发射滤光片捕获。
表 1 是使用 iBright FL1500 成像系统 成像时，与共价连接的 No-Stain 标记物兼容的部分荧光基团。任何一种荧光标记物都可以单独与 No-Stain 标记试剂和 iBright 成像系统使用。如果使用两个荧光基团和 No-Stain 蛋白标记试剂进行组合，则从 600 nm 范围中选择一个荧光基团，从 700 nm 范围中选择第二个荧光基团，以便每个荧光基团都可以通过不同的 iBright 发射滤光片成像。
表 1.与No-Stain 免染型蛋白标记试剂和 iBright FL1500 成像系统相兼容的荧光二抗。
| 反应次数 | 标准试剂盒可以标记 40 块小型印迹膜或 40 块小型凝胶，或两者的组合。 |
| 反应时间 | 10 分钟 |
| 凝胶兼容性 | 兼容任意凝胶类型（预制或手灌胶）及凝胶体系（Bis-Tris, Tris-甘氨酸, Tris-乙酸, Tricine） |
| 膜兼容性 | PVDF、硝酸纤维素膜 |
| 免疫检测试剂兼容性 | 与化学发光或荧光检测的所有下游免疫检测步骤兼容 |
| 激发和发射波长 | 激发波长：约 488 nm（epi 蓝光）， 发射波长：590 nm |
| 检测灵敏度 | 20 ng/条带 |
| 线性范围 | 每个泳道上样 1–80 μg 总蛋白 |
| 对成像仪的要求 | 与具有紫外或荧光光源的各种成像仪兼容，例如 iBright FL1500 智能成像系统 |
| 工作原理 | No-Stain 免染型蛋白标记试剂与所有蛋白质上的赖氨酸侧链的一部分形成共价键。 |
| 试剂盒组成和存储条件 | No-Stain激活剂（800 μL； -20℃储存）； No-Stain衍生剂（800 μL； -20℃储存）； No-Stain 标记缓冲液，20X（每个 2 x 20 mL； 15-30℃储存） |
| 保质期 | 自制造之日起 1 年 |
使用No-Stain试剂在印迹膜上标记蛋白的方案
图1.转膜后，使用No-Stain蛋白标记试剂对蛋白印迹进行标记。
当蛋白转印至硝酸纤维素膜或PVDF膜后即刻处理：
用20mL水，在转速~60 rpm的摇床上漂洗印迹膜2分钟。重复漂洗步骤1次。
No-Stain蛋白标记试剂的工作液制备和印迹膜标记方法如下：
当蛋白转印至硝酸纤维素膜或PVDF膜后即刻处理：
用20mL水，在转速~60 rpm的摇床上漂洗印迹膜2分钟。重复漂洗步骤1次。
No-Stain蛋白标记试剂的工作液制备和印迹膜标记方法如下：
- 将0.5mL No-Stain标记缓冲液加入9.5mL水中，即稀释20倍，得到10mL 1X No-Stain缓冲液
- 将20 µL No-Stain活化剂加入1X No-Stain缓冲液中。
- 将20 µL No-Stain 衍生剂加入步骤2的混合液中。
- 将No-Stain蛋白标记试剂工作液加到漂洗好的印迹膜上，摇晃孵育10分钟。
在 Western Blot 中，不同的蛋白质样品浓度、不一致的上样量、转印过程中的误差都会引起不同的结果。蛋白质归一化用于校正这种差异，是获得可靠且可重复的Western Blot定量 数据的关键步骤。蛋白质归一化的方法包括使用看家蛋白为内参，如 GAPDH、β-tubulin、β-actin 或 cyclophilin B，外源性上样对照或总蛋白为内参的归一化。
近年来，期刊编辑和审稿人一直要求采用可提高Western Blot定量数据准确性和重现性的方法。许多主流期刊已经制定了提交 WB 研究的标准指南，指南中的相关引文展示如下。
- “为了进行定量比较，应使用适当的试剂、参照物和使得信号在线性范围内的成像方法”——Nature
- “记录如何获得数据，信号强度是否与抗原上样量呈线性关系，以及蛋白质加量如何归一化。”——Journal of Biological Chemistry
- “尽可能使用总蛋白上样量进行信号强度的归一化（通过膜染色对总蛋白进行评估）”——Journal of Biological Chemistry
- “在没有证据表明实验操作不会影响表达的情况下，看家蛋白不应用于归一化。”——Journal of Biological Chemistry
使用看家蛋白也会有缺点，因为看家基因的蛋白表达会随着实验条件的变化而变化，而且它们通常容易造成Western Blot信号的过饱和。
使用 No-Stain 免染型蛋白标记试剂的总蛋白归一化可避免使用看家蛋白进行归一化的差异性和不准确性，并节省了使用免疫印迹法检测看家基因蛋白表达的时间、精力和成本，包括可能涉及的印迹剥离和重新检测。
一个准确的内参应在所有实验条件下，都体现信号强度和样品量之间的线性关系。通过使用No-Stain试剂标记膜上总蛋白获得的信号强度，就可在所有实验条件下，都确保与样品量呈线性关系（图 2）。因此，在定量Western Blot应用中，No-Stain 试剂可实现使用总蛋白作为理想内参。
No-Stain 试剂和看家蛋白的线性度比较
图 2 中的图表显示了使用 No-Stain 免染型蛋白标记试剂进行总蛋白归一化时，信号响应与每孔蛋白上样量的线性关系。来自看家蛋白的信号则在较高的裂解物上样量下饱和，带来了不准确的归一化结果。
图 2.使用 No-Stain 免染型蛋白标记试剂进行总蛋白归一化在Bolt 4-12% Bis-Tris Plus 预制胶中加入 10 至 50 μg 的 Hela 裂解物，并使用 MES电泳缓冲液进行电泳。使用 iBlot 2干转系统和iBlot 2 小型PVDF转印膜组（7 分钟方案），将凝胶中的蛋白质转移到 PVDF 膜上。在旋转平台上用 20 mL 的超纯水将 PVDF 膜漂洗两次，每次 2 分钟，然后用 10 mL 的 No-Stain 标记溶液摇动标记 10 分钟。接下来，在旋转平台上用 20 mL 的超纯水洗膜 3 次，每次 2 分钟，使用β-actin（货号 AM4302）、GAPDH（货号 398600）和 α-tubulin（产品编号 138000）一抗孵育印迹膜，然后加入山羊抗小鼠 Alexa Fluor Plus 680荧光二抗（货号 A21058）。使用 iBright 成像仪进行印迹成像。通过iBright 软件来定量泳道中的总蛋白信号。对使用 No-Stain试剂标记的整体上样区域的标绘数据进行线性回归值的测定（R2 = 0.9990），而 β-actin、GAPDH、和 α-tubulin 的 R2 值分别为 0.8851、0.9438 和 0.8332。
下面的图 3 显示了转印后采用 No-Stain 试剂标记蛋白所得的信号与蛋白上样量是成比例的线性关系。
图 3.膜上 No-Stain 标记的蛋白信号响应是线性的。在Bolt 4-12% Bis-Tris Plus 小型预制胶中，加入1 到 50 µg HeLa 裂解物，PageRuler 预染蛋白 marker 在第 1 道。使用 MES电泳缓冲液进行电泳后，使用 Invitrogen Power Blotter 和 Power Blotter 即用型转印膜组将蛋白质转移到 PVDF 膜上（10 分钟）。在旋转平台上用 20 mL 的超纯水漂洗 PVDF 膜两次，每次持续 2 分钟。在放有 PVDF 膜的皿中加入 10 mL No-Stain 标记溶液，开始 No-Stain 标记反应。在旋转平台上进行标记反应 10 分钟。然后在旋转平台上用 20 mL 的超纯水漂洗膜 3 次，每次持续 2 分钟。在iBright成像系统上使用No-Stain印迹膜epi模式（455-485 nm 激发光和 565-615 发射光）捕获图像
下面的图 4 是在硝酸纤维素膜上使用 No-Stain 蛋白标记试剂对目标蛋白进行归一化的实例。
图 4.使用 No-Stain 蛋白标记试剂和 iBright 成像系统进行定量 WB 分析。将 Novex 4-12% Tris-Glycine 楔形孔预制胶，加入表达 RB1 的 HeLa 细胞裂解物后电泳，总蛋白上样量为 0.6～10 μg。凝胶中的蛋白质使用 iBlot 2 干式转印系统转移到硝酸纤维素膜上。用 No-Stain 蛋白标记试剂标记硝酸纤维素膜 10 分钟，用 iBright 成像系统对标记的膜进行成像。在这张经过 No-Stain 标记的膜上，用 Alexa Fluor 645 标记抗体检测 RB1。用 iBright 归一化软件去定量加入 0.6-10 μg HeLa 裂解物的通道中总蛋白信号强度和 RB1 免疫检测条带的信号强度。绘制总蛋白上样量和 RB1 的信号强度图。
用 No-Stain 免染型蛋白标记试剂标记凝胶中的蛋白质
No-Stain 蛋白标记试剂在 10 分钟内与凝胶中的所有蛋白质中的赖氨酸侧链部分形成共价键。
- 传统凝胶染色试剂的理想替代品——无需脱色，可在宽线性范围内对上样的蛋白质裂解物（1–80 μg）进行精确归一化。
- 灵敏度高——检测下限为每条带 20 ng。
- 特异性好——只与蛋白质的赖氨酸侧链形成化学键。未结合的标记试剂不会自发荧光，确保带来卓越的信噪比。
- 灵活兼容——与任何凝胶类型兼容，无需改变你所用的凝胶即可体验免染的便捷性。
定量凝胶染色
图 5展示了使用 No-Stain 蛋白标记试剂标记凝胶中的蛋白质时，信号与蛋白上样量之间的线性关系。
图 5.定量凝胶染色在Bolt 4-12% Bis-Tris Plus 小型预制胶中上样2.5-80 μg的HeLa 裂解物，加入 MES电泳缓冲液后进行电泳。电泳后，按照 No-Stain 蛋白标记试剂说明书中的实验方案，对凝胶中的蛋白质进行标记，凝胶用 iBright 成像系统成像，凝胶成像仪的激发波长（490-520 nm），发射光的滤光片为 565-615 nm。
No-Stain蛋白标记试剂兼容化学发光和荧光检测体系，因此，您可以继续使用目前的化学发光酶标二抗。因此，您可以使用目前化学发光的酶标二抗。在设计使用荧光抗体的实验体系时，选择不与 No-Stain 标记物的激发和发射光谱重叠的荧光基团是很重要的，当与赖氨酸残基共价结合时，No-Stain 在 488 nm 激发，在约 590 nm 发射。荧光基团的选择取决于你的荧光成像仪的滤光片组合。
你可以将荧光二抗的激发光谱和发射光谱与 No-Stain 标记物的激发光谱和发射光谱进行比较，以评估与当前荧光二抗的兼容性。共价连接的 No-Stain 标记物的激发和发射光谱如图 6 所示。
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图 6.共价连接的 No-Stain 标记物的激发光谱和发射光谱。共价连接的 No-Stain 标记物的激发最大值约为 488 nm，发射最大值为 590 nm。光谱分析表明，No-Stain 标记物的信号可以用紫外或荧光光源成像，信号可以用宽范围的发射滤光片捕获。
表 1 是使用 iBright FL1500 成像系统 成像时，与共价连接的 No-Stain 标记物兼容的部分荧光基团。任何一种荧光标记物都可以单独与 No-Stain 标记试剂和 iBright 成像系统使用。如果使用两个荧光基团和 No-Stain 蛋白标记试剂进行组合，则从 600 nm 范围中选择一个荧光基团，从 700 nm 范围中选择第二个荧光基团，以便每个荧光基团都可以通过不同的 iBright 发射滤光片成像。
表 1.与No-Stain 免染型蛋白标记试剂和 iBright FL1500 成像系统相兼容的荧光二抗。
资源
仅供科研使用，不可用于诊断目的。