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5步优化多重荧光蛋白质免疫印迹检测
多重荧光蛋白质印迹法由于可提供准确的定量结果、稳定的信号，并可在单个印迹上同时检测多个蛋白质靶标，从而使该技术的应用越来越普遍。借助用于蛋白质免疫印迹检测的多种荧光染料和抗体以及新的成像系统，多重蛋白质免疫印迹检测可以节省时间、降低成本并提高数据生成和收集的效率。
在此，我们将多重荧光蛋白质免疫印迹检测分为 5 个步骤，从样品制备到数据收集，帮助您优化每个步骤并避免出现错误，获得理想结果。
按照以下 5 个步骤进行多重荧光蛋白质免疫印迹检测
蛋白质凝胶电泳的样品制备
用于蛋白质免疫印迹检测的蛋白质样品可通过多种来源获得，包括组织、细胞和亚细胞部分。从这些来源样品中分离和纯化蛋白质的方法很多。
当制备用于蛋白质免疫印迹实验的蛋白质样品时，避免引入可导致背景荧光的干扰物至关重要。溴酚蓝在成像过程中可形成背景荧光。
总蛋白抽提试剂和试剂盒制备的蛋白样品可与蛋白质免疫印迹检测兼容，如下所示：
| 样品类型 | 目标蛋白 | 推荐的 Thermo Scientific 试剂或试剂盒 |
|---|---|---|
| 原代培养或哺乳动物细胞或组织 | 总蛋白提取物 | M-PER 试剂 T-PER 试剂 N-PER 试剂 RIPA 裂解液 Pierce IP 裂解缓冲液 |
| 培养的哺乳动物细胞或组织 | 亚细胞分级分离或细胞器分离 | NE-PER 试剂 亚细胞分级分离试剂盒 线粒体分离试剂盒 Pierce 细胞表面蛋白分离试剂盒 Syn-PER试剂 溶酶体富集试剂盒 |
| 细菌细胞 | 总蛋白提取 | B-PER 试剂 |
| 酵母细胞 | 总蛋白提取 | Y-PER 试剂 Y-PER Plus 试剂 |
| 昆虫细胞（杆状病毒） | 总蛋白提取 | I-PER 试剂 |
| 植物组织（叶、茎、根、花） | 总蛋白提取 | P-PER 试剂 |
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蛋白定量
了解蛋白质样品的浓度，有助于您确定电泳步骤中凝胶的上样量。多种蛋白定量方法可用于测量样品的蛋白质浓度。使用蛋白定量方法选择指南帮助您确定适合您检测需求的蛋白定量产品。
除了可靠的蛋白质定量和分析之外，还可以使用 Thermo Scientific Multiskan Sky 全波长酶标仪进行 UV-Vis 光度研究应用，例如 DNA 和 RNA 分析以及 ELISA。Multiskan Sky 波长范围宽（200-1000 nm），具有光程校正功能和快速读板速度。可选的 µDrop 板可进行微体积分析—类似于一次执行多达 16 次 NanoDrop 测量！直观的触摸屏用户界面、机载软件和内置方案使您可以直接从仪器上运行快速测量。另外，购买任何仪器都可以使用我们无许可限制且易于使用的 Thermo Scientific SkanIt 软件，访问我们广泛的现成方案在线库。
通过凝胶电泳，根据分子量分离蛋白质
使用蛋白质凝胶电泳技术，分离制备的蛋白质样品是多重荧光蛋白质印迹的第二步。通过仔细选择蛋白质凝胶的体系和聚丙烯酰胺浓度，可实现靶蛋白之间的高效分离。推荐使用聚丙烯酰胺的浓度从凝胶顶部到底部呈梯度变化的梯度胶，获取更清晰的条带分离结果。
选择适合的蛋白质凝胶
通过为蛋白质选择适合的蛋白质凝胶的体系，实现靶蛋白的高效分离。我们的蛋白预制胶有四种不同的体系。凝胶体系的选择取决于待分离的蛋白质丰度和蛋白质分子量大小。
寻找适合的蛋白质凝胶和缓冲液，实现蛋白质的高效分离。
| 蛋白样品类型 | 凝胶体系 | 预制胶 | 上样缓冲液* | 蛋白质分子量标准 | 电泳缓冲液 | 转印缓冲液 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 低丰度/翻译后修饰 宽分子量范围（6-400 kDa） | Bis-Tris 体系 | Bolt Bis-Tris Plus预制胶（上样量达 60 μL） | 荧光兼容型上样缓冲液 | iBright 预染蛋白分子量标准 | Bolt MOPS SDS 缓冲液（15–260 kDa）；Bolt MES SDS 缓冲液（3.5–160 kDa）；为还原型样品添加 Bolt 抗氧化剂 | Bolt转印缓冲液 |
| NuPAGE Bis-Tris 预制胶 | NuPAGE MOPS SDS 缓冲液（15–260 kDa）；NuPAGE MES SDS 缓冲液（3.5–160 kDa）；为还原型样品添加 Bolt 抗氧化剂 | NuPAGE 转印缓冲液 | ||||
| 高丰度 宽分子量范围（6-400 kDa） | Tris-甘氨酸 | Novex Tris-甘氨酸预制胶，楔形上样孔 | Novex Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液 | Novex Tris-甘氨酸转印缓冲液 | ||
| 高分子量范围（40-500 kDa） | Tris-乙酸 | NuPAGE Tris-乙酸预制胶 | Spectra 多色高分子量蛋白分子量标准 | NuPAGE Tris-Acate SDS 电泳缓冲液 | NuPAGE 转印缓冲液 | |
| 低分子量范围（2.5-40 kDa） | Tricine | Novex Tricine 预制胶 | Spectra 多色低分子量蛋白分子量标准 | Novex Tricing SDS 电泳缓冲液 | Novex Tris-甘氨酸转印缓冲液 | |
| *将样品在 70°C 下加热 10 分钟。 | ||||||
上样缓冲液
含溴酚蓝的上样缓冲液会产生荧光，增加背景荧光信号。如果使用含溴酚蓝的上样缓冲液，可延长电泳时间使得染料前沿从凝胶中跑出，或在转印后从膜上裁掉，从而避免其背景荧光信号。
尝试使用不含溴酚蓝的荧光兼容型上样缓冲液，例如 Invitrogen 荧光兼容型上样缓冲液（货号 LC2570）。
蛋白质分子量标准
对于常规分子量范围蛋白质的多重荧光蛋白质免疫印迹检测，建议使用 iBright 预染蛋白分子量标准。其可在电泳过程中直接目测蛋白质条带，并具有以下特征：
- 十种蓝色预染的蛋白条带，还标记了荧光基团，可以进行直接目测和近红外荧光检测
- 两种未染色的蛋白条带（30 和 80 kDa），可以直接进行化学发光或荧光检测
可以使用常见的预染蛋白质分子量标准，但是如果分子量标准包含荧光条带，则需要优化上样量，因为过量上样可增加背景荧光并使信号渗漏到相邻泳道。 iBright 预染蛋白分子量标准使您可以减少分子量标准的凝胶上样量：通常，2-4 µL 足以实现可视化和荧光检测。
蛋白预制胶旗舰套装
蛋白预制胶旗舰套装是首次开始使用 Invitrogen 蛋白预制胶进行多重荧光免疫印迹实验的经济之选。每种体系的蛋白预制胶均提供蛋白预制胶旗舰套装，套装包含小型蛋白预制胶、缓冲液、分子量标准和小型电泳槽，为您节省大量实验成本。iBright 预染蛋白分子量标准和 Invitrogen 荧光兼容上样缓冲液（货号：LC2570）未包含在蛋白预制胶套装中，可以单独订购。
将蛋白从凝胶转印到固相印迹膜上
蛋白质电泳后，从聚丙烯酰胺凝胶有效转移到硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上是蛋白质印迹的重要步骤，便于使用免疫检测技术检测特定的蛋白质。
凝胶转印的电泳方法可以分为湿转、半干转和干转。
使用下面的选择表对比转印方法以及所需的设备、缓冲液和时间要求。
| 传统湿法转印 | 半干式转印 | 干式转印 | ||
|---|---|---|---|---|
 Mini Blot 模块 |  Power Blotter |  Power Blotter XL |  iBlot 2 干式转印系统 | |
| 转印时间 | 60 min | 5-10 分钟 | 5-10 分钟 | 7 min |
| 设备容量 | 1 个 mini 凝胶（每个模块）或 2 个 mini 凝胶（每个电泳槽配2个模块） | 2 mini 凝胶 1 midi 凝胶 | 4 mini 凝胶或 2 midi 凝胶 | 2 mini 凝胶 1 midi 凝胶 |
| 转印区域 | 9 x 9 cm | 10 x 18 cm | 21 x 22.5 cm | 8.5 x 13.5 cm |
| 需要转印缓冲液 | 是，（每个模块 200-400 mL） | 取决于所选择的耗材： 是–如果使用预切膜和滤纸（每份 mini 凝胶 50 mL 或每份 midi 凝胶 100 mL）否–如果使用现成的预组装转印膜组（无需转印缓冲液） | 取决于所选择的耗材： 是–如果使用预切膜和滤纸（每份 mini 凝胶 50 mL 或每份 midi 凝胶 100 mL）否–如果使用现成的 预组装转印膜组s（无需转印缓冲液） | 否 |
| 电源 | 外部 | 内部 | 内部 | 内部 |
| 立即订购 | 立即订购 | 立即订购 | 立即订购 | |
视频：使用 iBlot 2 快速转印设备轻松实现 7 分钟蛋白质凝胶转移。
转印膜
若要消除背景荧光的主要来源，使用低自发荧光膜，包括硝化纤维素和特殊的低荧光 PVDF 膜，例如 Thermo Scientific 硝酸纤维素膜（货号：88018）和低荧光 PVDF 转移膜（货号：22860）。佩戴手套并使用清洁钝镊子时才能处理膜，减少膜上的污染和划痕，这些污染和划痕可导致背景荧光和伪影。
提示：避免使用圆珠笔或者水性笔在膜上书写，因为许多墨水会产生荧光。请改用铅笔。
转印缓冲液
使用下表确定适合您蛋白凝胶的转移缓冲液。
| 蛋白质样品类型 | 凝胶体系 | 预制凝胶 | 转印缓冲液 |
|---|---|---|---|
| 低丰度/翻译后修饰 宽分子量范围（6-400 kDa） | Bis-Tris 体系 | Bolt Bis-Tris Plus（负载量达 60 μL） | 免疫印迹转印缓冲液 |
| NuPAGE Bis-Tris 预制胶 | NuPAGE 转印缓冲液 | ||
| 高丰度 宽分子量范围（6-400 kDa） | Tris-甘氨酸 | Novex Tris-甘氨酸，楔形孔形式 | Novex Tris-甘氨酸转印缓冲液 |
| 高分子量范围（40-500 kDa） | Tris-乙酸 | NuPAGE Tris-乙酸凝胶 | NuPAGE 转印缓冲液 |
| 低分子量范围（2.5-40 kDa） | Tricine | Novex Tricine Mini 凝胶 | Novex Tris-甘氨酸转印缓冲液 |
用荧光标记抗体检测转印后的蛋白质
若要成功进行多重荧光蛋白质免疫印迹，需要谨慎选择抗体和荧光标记。下载我们的应用资料：荧光免疫印迹-用于全面探讨抗体和荧光标记选择的多重检测指南。
选择荧光标记
选择具有不同光谱特性的荧光基团，避免荧光通道的交叉干扰。下图 1 和图 2 显示了选择荧光基团用于不同激发光谱和发射光谱多重检测的示例。关于可在 iBright FL1500 成像系统上实现 1- 至 4-探针多重检测的多重荧光基团组合的示例参见表 1。
表 1.使用 iBright FL 成像系统成功进行多重检测的荧光基团组合示例。
| 靶标数量 | 偶联物 1 | 偶联物 2 | 偶联物 3 | 偶联物 4 |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Alexa Fluor Plus 647 | |||
| 2 | Alexa Fluor Plus 647 | Alexa Fluor 546 | ||
| 3 | Alexa Fluor Plus 647 | Alexa Fluor 546 | Alexa Fluor Plus 488 | |
| 4 | Alexa Fluor Plus 647 | Alexa Fluor 546 | Alexa Fluor Plus 488 | Alexa Fluor Plus 800 |
图 1.具有不同激发光谱的荧光基团的多重实验示例。在此示例中，在 Fluorescent SpectraViewer 上生成的 Alexa Fluor Plus 488 和 Alexa Fluor 546 荧光基团的激发光谱（虚线）在激发滤光片范围内具有最小重叠。尽管两个荧光基团的一部分发射光谱（实线）都在发射滤光片发射范围内，但 Alexa Fluor 546 不会被为 Alexa Fluor Plus 488 选择的激发滤光片激发，因此 Alexa Fluor 546 不产生可穿过发射滤光片的荧光。
图 2.具有不同发射光谱的荧光基团的多重实验示例。在此示例中，在 Fluorescent SpectraViewer 上生成的 Alexa Fluor Plus 647 和 Alexa Fluor 790 的发射光谱（实线）在两个发射滤光片范围内没有重叠。尽管两个荧光基团的一部分激发光谱（虚线）都在激发滤光片 1 的范围内，但在该激发范围产生的任意 Alexa Fluor 790 荧光都不在允许通过发射滤光片 1 的波长内，因此 Alexa Fluor 790 产生的荧光不会到达该通道的成像检测器。
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检测过程自动化
我们的 Invitrogen iBind 和 iBind Flex 免疫印迹设备具备可以进行所有封闭、抗体孵育和洗涤步骤的免手动操作选项。有关更多详情，请访问 thermofisher.com/ibind。
常见问题指南
| 问题 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 信号微弱或无信号 | 一抗量不足 |
|
| 抗体丧失活性 |
| |
| 成像曝光时间太短 |
| |
| 仪器设置不正确 |
| |
| 去垢剂的使用 |
| |
| 封闭缓冲液可阻断抗原 |
| |
| 凝胶上的样品量不足 |
| |
| 蛋白质转印不良或转印后蛋白质损失 |
| |
| 非特异性条带 | 对目标靶标的抗体特异性不强 |
|
| 样品完整性不足 |
| |
| 多重检测中的抗体交叉反应 |
| |
| 执行多重检测时从另一个通道中发出荧光渗漏（出现意外条带） |
| |
| 背景问题（高、不均或有斑点） | 膜污染导致高背景 |
|
| 蛋白质marker或分子量标准加入量过高形成伪影 |
| |
| 非最佳洗涤或稀释溶液 |
| |
| 二抗过量导致高背景 |
| |
| 膜干燥导致背景斑点或不均匀 |
| |
| 膜选择不适合 |
| |
| 印迹膜上的灰尘和指印 |
|
荧光免疫印迹成像和蛋白质定量
如今，随着成像软件技术的发展和仪器灵敏度的提高，荧光图像采集和定量蛋白质印迹分析变得更加容易了。确保计划使用的仪器能够捕获要检测的荧光团数量，以及成像仪是否具有与荧光团一起使用的适合滤光片。
我们提供功能强大、易于操作的 iBright FL1500 成像系统，进而提供灵敏、快速的多模式图像采集（参见下图 2）。iBright FL1500 能够轻松采集四重荧光图像。配置12.1寸触摸屏界面和智能设操作、分析软件。
图 2.多重荧光蛋白质印迹检测的四通道成像。
多达四个不同的蛋白质可以在同一印迹上同时成像。使用 1-Step Human High-Yield Mini IVT 试剂盒（货号：88890）和适当的表达克隆，在 HeLa 细胞提取物中表达 HA 标记的 RB-1。得到的反应混合物用于还原 型SDS-PAGE，连续稀释后，在 Novex WedgeWell 4-20％Tris-甘氨酸凝胶（货号：XP04200PK2）上进行电泳。使用 Pierce Power Blotter（货号：PB0013）将蛋白质转印至 PVDF 膜上，然后使用以下一抗封闭：鸡抗钙网蛋白（货号：PA1-903），兔抗 -HSP90（货号：PA3-013）和小鼠抗-p23（货号：MA3-414）。对膜进行洗涤，并使用以下二抗在 TBS-Tween 20 中孵育：山羊抗鸡 Alexa Fluor 546（货号 A11040，伪彩色为黄色），山羊抗兔 Alexa Fluor Plus 800（货号：A32735，伪彩色为绿色）和山羊抗小鼠 Alexa Fluor Plus 680（货号：A32729，伪彩色为红色）。再次洗涤该膜，并使用直接偶联至 Alexa Fluor 488（货号：26183-D488，伪彩色为蓝色）的小鼠抗-HA 一抗在 TBS-Tween 20 中孵育 1 小时。洗涤膜并使用 iBright FL1500 成像系统成像。定量分析
蛋白质归一化是获得可靠、高重复性定量免疫印迹的关键步骤，可以使用管家蛋白质或总蛋白质归一化进行。在理想条件下，无需进行标准化，但样品上样和转印效率等因素使蛋白质印迹归一化变得至关重要。总蛋白归一化是一种更可靠的方法，因为管家蛋白质可受实验条件的影响。为了对蛋白质印迹数据进行总蛋白归一化，Invitrogen No-Stain蛋白质标记试剂是一种快速、易于使用的试剂，可用在电泳凝胶或者转印后应用于膜上，并提供灵敏线性检测。
iBright FL1500 成像系统配置使用No-Stain蛋白标记试剂和许多其他方法轻松进行归一化的软件。
下载此技术说明，该说明提供了使用内部上样对照进行归一化的基本原理，并描述了如何准确对免疫印迹进行归一化以获得有意义的可重现数据。
荧光免疫印迹抗体剥离及重检测
若要使用其他抗体重新探测印迹，请使用 Restore 荧光蛋白质印迹抗体剥离液。Restore 荧光蛋白质印迹抗体剥离液使 PVDF 膜可重复使用，简化了免疫印迹优化过程，并允许使用不同的一抗重新检测其他靶标。Restore 荧光蛋白质印迹抗体剥离液仅适用于低荧光 PVDF 膜。
您需要完整的免疫印迹流程解决方案吗？
亦或是希望提高免疫印迹某个关键步骤的结果？
蛋白质凝胶电泳的样品制备
用于蛋白质免疫印迹检测的蛋白质样品可通过多种来源获得，包括组织、细胞和亚细胞部分。从这些来源样品中分离和纯化蛋白质的方法很多。
当制备用于蛋白质免疫印迹实验的蛋白质样品时，避免引入可导致背景荧光的干扰物至关重要。溴酚蓝在成像过程中可形成背景荧光。
总蛋白抽提试剂和试剂盒制备的蛋白样品可与蛋白质免疫印迹检测兼容，如下所示：
| 样品类型 | 目标蛋白 | 推荐的 Thermo Scientific 试剂或试剂盒 |
|---|---|---|
| 原代培养或哺乳动物细胞或组织 | 总蛋白提取物 | M-PER 试剂 T-PER 试剂 N-PER 试剂 RIPA 裂解液 Pierce IP 裂解缓冲液 |
| 培养的哺乳动物细胞或组织 | 亚细胞分级分离或细胞器分离 | NE-PER 试剂 亚细胞分级分离试剂盒 线粒体分离试剂盒 Pierce 细胞表面蛋白分离试剂盒 Syn-PER试剂 溶酶体富集试剂盒 |
| 细菌细胞 | 总蛋白提取 | B-PER 试剂 |
| 酵母细胞 | 总蛋白提取 | Y-PER 试剂 Y-PER Plus 试剂 |
| 昆虫细胞（杆状病毒） | 总蛋白提取 | I-PER 试剂 |
| 植物组织（叶、茎、根、花） | 总蛋白提取 | P-PER 试剂 |
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蛋白定量
了解蛋白质样品的浓度，有助于您确定电泳步骤中凝胶的上样量。多种蛋白定量方法可用于测量样品的蛋白质浓度。使用蛋白定量方法选择指南帮助您确定适合您检测需求的蛋白定量产品。
除了可靠的蛋白质定量和分析之外，还可以使用 Thermo Scientific Multiskan Sky 全波长酶标仪进行 UV-Vis 光度研究应用，例如 DNA 和 RNA 分析以及 ELISA。Multiskan Sky 波长范围宽（200-1000 nm），具有光程校正功能和快速读板速度。可选的 µDrop 板可进行微体积分析—类似于一次执行多达 16 次 NanoDrop 测量！直观的触摸屏用户界面、机载软件和内置方案使您可以直接从仪器上运行快速测量。另外，购买任何仪器都可以使用我们无许可限制且易于使用的 Thermo Scientific SkanIt 软件，访问我们广泛的现成方案在线库。
通过凝胶电泳，根据分子量分离蛋白质
使用蛋白质凝胶电泳技术，分离制备的蛋白质样品是多重荧光蛋白质印迹的第二步。通过仔细选择蛋白质凝胶的体系和聚丙烯酰胺浓度，可实现靶蛋白之间的高效分离。推荐使用聚丙烯酰胺的浓度从凝胶顶部到底部呈梯度变化的梯度胶，获取更清晰的条带分离结果。
选择适合的蛋白质凝胶
通过为蛋白质选择适合的蛋白质凝胶的体系，实现靶蛋白的高效分离。我们的蛋白预制胶有四种不同的体系。凝胶体系的选择取决于待分离的蛋白质丰度和蛋白质分子量大小。
寻找适合的蛋白质凝胶和缓冲液，实现蛋白质的高效分离。
| 蛋白样品类型 | 凝胶体系 | 预制胶 | 上样缓冲液* | 蛋白质分子量标准 | 电泳缓冲液 | 转印缓冲液 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 低丰度/翻译后修饰 宽分子量范围（6-400 kDa） | Bis-Tris 体系 | Bolt Bis-Tris Plus预制胶（上样量达 60 μL） | 荧光兼容型上样缓冲液 | iBright 预染蛋白分子量标准 | Bolt MOPS SDS 缓冲液（15–260 kDa）；Bolt MES SDS 缓冲液（3.5–160 kDa）；为还原型样品添加 Bolt 抗氧化剂 | Bolt转印缓冲液 |
| NuPAGE Bis-Tris 预制胶 | NuPAGE MOPS SDS 缓冲液（15–260 kDa）；NuPAGE MES SDS 缓冲液（3.5–160 kDa）；为还原型样品添加 Bolt 抗氧化剂 | NuPAGE 转印缓冲液 | ||||
| 高丰度 宽分子量范围（6-400 kDa） | Tris-甘氨酸 | Novex Tris-甘氨酸预制胶，楔形上样孔 | Novex Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液 | Novex Tris-甘氨酸转印缓冲液 | ||
| 高分子量范围（40-500 kDa） | Tris-乙酸 | NuPAGE Tris-乙酸预制胶 | Spectra 多色高分子量蛋白分子量标准 | NuPAGE Tris-Acate SDS 电泳缓冲液 | NuPAGE 转印缓冲液 | |
| 低分子量范围（2.5-40 kDa） | Tricine | Novex Tricine 预制胶 | Spectra 多色低分子量蛋白分子量标准 | Novex Tricing SDS 电泳缓冲液 | Novex Tris-甘氨酸转印缓冲液 | |
| *将样品在 70°C 下加热 10 分钟。 | ||||||
上样缓冲液
含溴酚蓝的上样缓冲液会产生荧光，增加背景荧光信号。如果使用含溴酚蓝的上样缓冲液，可延长电泳时间使得染料前沿从凝胶中跑出，或在转印后从膜上裁掉，从而避免其背景荧光信号。
尝试使用不含溴酚蓝的荧光兼容型上样缓冲液，例如 Invitrogen 荧光兼容型上样缓冲液（货号 LC2570）。
蛋白质分子量标准
对于常规分子量范围蛋白质的多重荧光蛋白质免疫印迹检测，建议使用 iBright 预染蛋白分子量标准。其可在电泳过程中直接目测蛋白质条带，并具有以下特征：
- 十种蓝色预染的蛋白条带，还标记了荧光基团，可以进行直接目测和近红外荧光检测
- 两种未染色的蛋白条带（30 和 80 kDa），可以直接进行化学发光或荧光检测
可以使用常见的预染蛋白质分子量标准，但是如果分子量标准包含荧光条带，则需要优化上样量，因为过量上样可增加背景荧光并使信号渗漏到相邻泳道。 iBright 预染蛋白分子量标准使您可以减少分子量标准的凝胶上样量：通常，2-4 µL 足以实现可视化和荧光检测。
蛋白预制胶旗舰套装
蛋白预制胶旗舰套装是首次开始使用 Invitrogen 蛋白预制胶进行多重荧光免疫印迹实验的经济之选。每种体系的蛋白预制胶均提供蛋白预制胶旗舰套装，套装包含小型蛋白预制胶、缓冲液、分子量标准和小型电泳槽，为您节省大量实验成本。iBright 预染蛋白分子量标准和 Invitrogen 荧光兼容上样缓冲液（货号：LC2570）未包含在蛋白预制胶套装中，可以单独订购。
将蛋白从凝胶转印到固相印迹膜上
蛋白质电泳后，从聚丙烯酰胺凝胶有效转移到硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上是蛋白质印迹的重要步骤，便于使用免疫检测技术检测特定的蛋白质。
凝胶转印的电泳方法可以分为湿转、半干转和干转。
使用下面的选择表对比转印方法以及所需的设备、缓冲液和时间要求。
| 传统湿法转印 | 半干式转印 | 干式转印 | ||
|---|---|---|---|---|
Mini Blot 模块 | Power Blotter | Power Blotter XL | iBlot 2 干式转印系统 | |
| 转印时间 | 60 min | 5-10 分钟 | 5-10 分钟 | 7 min |
| 设备容量 | 1 个 mini 凝胶（每个模块）或 2 个 mini 凝胶（每个电泳槽配2个模块） | 2 mini 凝胶 1 midi 凝胶 | 4 mini 凝胶或 2 midi 凝胶 | 2 mini 凝胶 1 midi 凝胶 |
| 转印区域 | 9 x 9 cm | 10 x 18 cm | 21 x 22.5 cm | 8.5 x 13.5 cm |
| 需要转印缓冲液 | 是，（每个模块 200-400 mL） | 取决于所选择的耗材： 是–如果使用预切膜和滤纸（每份 mini 凝胶 50 mL 或每份 midi 凝胶 100 mL）否–如果使用现成的预组装转印膜组（无需转印缓冲液） | 取决于所选择的耗材： 是–如果使用预切膜和滤纸（每份 mini 凝胶 50 mL 或每份 midi 凝胶 100 mL）否–如果使用现成的 预组装转印膜组s（无需转印缓冲液） | 否 |
| 电源 | 外部 | 内部 | 内部 | 内部 |
| 立即订购 | 立即订购 | 立即订购 | 立即订购 | |
视频：使用 iBlot 2 快速转印设备轻松实现 7 分钟蛋白质凝胶转移。
转印膜
若要消除背景荧光的主要来源，使用低自发荧光膜，包括硝化纤维素和特殊的低荧光 PVDF 膜，例如 Thermo Scientific 硝酸纤维素膜（货号：88018）和低荧光 PVDF 转移膜（货号：22860）。佩戴手套并使用清洁钝镊子时才能处理膜，减少膜上的污染和划痕，这些污染和划痕可导致背景荧光和伪影。
提示：避免使用圆珠笔或者水性笔在膜上书写，因为许多墨水会产生荧光。请改用铅笔。
转印缓冲液
使用下表确定适合您蛋白凝胶的转移缓冲液。
| 蛋白质样品类型 | 凝胶体系 | 预制凝胶 | 转印缓冲液 |
|---|---|---|---|
| 低丰度/翻译后修饰 宽分子量范围（6-400 kDa） | Bis-Tris 体系 | Bolt Bis-Tris Plus（负载量达 60 μL） | 免疫印迹转印缓冲液 |
| NuPAGE Bis-Tris 预制胶 | NuPAGE 转印缓冲液 | ||
| 高丰度 宽分子量范围（6-400 kDa） | Tris-甘氨酸 | Novex Tris-甘氨酸，楔形孔形式 | Novex Tris-甘氨酸转印缓冲液 |
| 高分子量范围（40-500 kDa） | Tris-乙酸 | NuPAGE Tris-乙酸凝胶 | NuPAGE 转印缓冲液 |
| 低分子量范围（2.5-40 kDa） | Tricine | Novex Tricine Mini 凝胶 | Novex Tris-甘氨酸转印缓冲液 |
用荧光标记抗体检测转印后的蛋白质
若要成功进行多重荧光蛋白质免疫印迹，需要谨慎选择抗体和荧光标记。下载我们的应用资料：荧光免疫印迹-用于全面探讨抗体和荧光标记选择的多重检测指南。
选择荧光标记
选择具有不同光谱特性的荧光基团，避免荧光通道的交叉干扰。下图 1 和图 2 显示了选择荧光基团用于不同激发光谱和发射光谱多重检测的示例。关于可在 iBright FL1500 成像系统上实现 1- 至 4-探针多重检测的多重荧光基团组合的示例参见表 1。
表 1.使用 iBright FL 成像系统成功进行多重检测的荧光基团组合示例。
| 靶标数量 | 偶联物 1 | 偶联物 2 | 偶联物 3 | 偶联物 4 |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Alexa Fluor Plus 647 | |||
| 2 | Alexa Fluor Plus 647 | Alexa Fluor 546 | ||
| 3 | Alexa Fluor Plus 647 | Alexa Fluor 546 | Alexa Fluor Plus 488 | |
| 4 | Alexa Fluor Plus 647 | Alexa Fluor 546 | Alexa Fluor Plus 488 | Alexa Fluor Plus 800 |
图 1.具有不同激发光谱的荧光基团的多重实验示例。在此示例中，在 Fluorescent SpectraViewer 上生成的 Alexa Fluor Plus 488 和 Alexa Fluor 546 荧光基团的激发光谱（虚线）在激发滤光片范围内具有最小重叠。尽管两个荧光基团的一部分发射光谱（实线）都在发射滤光片发射范围内，但 Alexa Fluor 546 不会被为 Alexa Fluor Plus 488 选择的激发滤光片激发，因此 Alexa Fluor 546 不产生可穿过发射滤光片的荧光。
图 2.具有不同发射光谱的荧光基团的多重实验示例。在此示例中，在 Fluorescent SpectraViewer 上生成的 Alexa Fluor Plus 647 和 Alexa Fluor 790 的发射光谱（实线）在两个发射滤光片范围内没有重叠。尽管两个荧光基团的一部分激发光谱（虚线）都在激发滤光片 1 的范围内，但在该激发范围产生的任意 Alexa Fluor 790 荧光都不在允许通过发射滤光片 1 的波长内，因此 Alexa Fluor 790 产生的荧光不会到达该通道的成像检测器。
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检测过程自动化
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常见问题指南
| 问题 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 信号微弱或无信号 | 一抗量不足 |
|
| 抗体丧失活性 |
| |
| 成像曝光时间太短 |
| |
| 仪器设置不正确 |
| |
| 去垢剂的使用 |
| |
| 封闭缓冲液可阻断抗原 |
| |
| 凝胶上的样品量不足 |
| |
| 蛋白质转印不良或转印后蛋白质损失 |
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| 非特异性条带 | 对目标靶标的抗体特异性不强 |
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| 样品完整性不足 |
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| 多重检测中的抗体交叉反应 |
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| 执行多重检测时从另一个通道中发出荧光渗漏（出现意外条带） |
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| 背景问题（高、不均或有斑点） | 膜污染导致高背景 |
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| 蛋白质marker或分子量标准加入量过高形成伪影 |
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| 非最佳洗涤或稀释溶液 |
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| 二抗过量导致高背景 |
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| 膜干燥导致背景斑点或不均匀 |
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| 膜选择不适合 |
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| 印迹膜上的灰尘和指印 |
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荧光免疫印迹成像和蛋白质定量
如今，随着成像软件技术的发展和仪器灵敏度的提高，荧光图像采集和定量蛋白质印迹分析变得更加容易了。确保计划使用的仪器能够捕获要检测的荧光团数量，以及成像仪是否具有与荧光团一起使用的适合滤光片。
我们提供功能强大、易于操作的 iBright FL1500 成像系统，进而提供灵敏、快速的多模式图像采集（参见下图 2）。iBright FL1500 能够轻松采集四重荧光图像。配置12.1寸触摸屏界面和智能设操作、分析软件。
图 2.多重荧光蛋白质印迹检测的四通道成像。
多达四个不同的蛋白质可以在同一印迹上同时成像。使用 1-Step Human High-Yield Mini IVT 试剂盒（货号：88890）和适当的表达克隆，在 HeLa 细胞提取物中表达 HA 标记的 RB-1。得到的反应混合物用于还原 型SDS-PAGE，连续稀释后，在 Novex WedgeWell 4-20％Tris-甘氨酸凝胶（货号：XP04200PK2）上进行电泳。使用 Pierce Power Blotter（货号：PB0013）将蛋白质转印至 PVDF 膜上，然后使用以下一抗封闭：鸡抗钙网蛋白（货号：PA1-903），兔抗 -HSP90（货号：PA3-013）和小鼠抗-p23（货号：MA3-414）。对膜进行洗涤，并使用以下二抗在 TBS-Tween 20 中孵育：山羊抗鸡 Alexa Fluor 546（货号 A11040，伪彩色为黄色），山羊抗兔 Alexa Fluor Plus 800（货号：A32735，伪彩色为绿色）和山羊抗小鼠 Alexa Fluor Plus 680（货号：A32729，伪彩色为红色）。再次洗涤该膜，并使用直接偶联至 Alexa Fluor 488（货号：26183-D488，伪彩色为蓝色）的小鼠抗-HA 一抗在 TBS-Tween 20 中孵育 1 小时。洗涤膜并使用 iBright FL1500 成像系统成像。定量分析
蛋白质归一化是获得可靠、高重复性定量免疫印迹的关键步骤，可以使用管家蛋白质或总蛋白质归一化进行。在理想条件下，无需进行标准化，但样品上样和转印效率等因素使蛋白质印迹归一化变得至关重要。总蛋白归一化是一种更可靠的方法，因为管家蛋白质可受实验条件的影响。为了对蛋白质印迹数据进行总蛋白归一化，Invitrogen No-Stain蛋白质标记试剂是一种快速、易于使用的试剂，可用在电泳凝胶或者转印后应用于膜上，并提供灵敏线性检测。
iBright FL1500 成像系统配置使用No-Stain蛋白标记试剂和许多其他方法轻松进行归一化的软件。
下载此技术说明，该说明提供了使用内部上样对照进行归一化的基本原理，并描述了如何准确对免疫印迹进行归一化以获得有意义的可重现数据。
荧光免疫印迹抗体剥离及重检测
若要使用其他抗体重新探测印迹，请使用 Restore 荧光蛋白质印迹抗体剥离液。Restore 荧光蛋白质印迹抗体剥离液使 PVDF 膜可重复使用，简化了免疫印迹优化过程，并允许使用不同的一抗重新检测其他靶标。Restore 荧光蛋白质印迹抗体剥离液仅适用于低荧光 PVDF 膜。
您需要完整的免疫印迹流程解决方案吗？
亦或是希望提高免疫印迹某个关键步骤的结果？
仅供科研使用，不可用于诊断目的。