荧光蛋白质印迹检测

蛋白质印迹是一种功能强大、广泛应用的蛋白质检测应用技术。随着 Invitrogen iBright FL1000 成像系统等先进数字成像仪器的引入以及荧光标记技术的发展，荧光蛋白质印迹系统越来越受欢迎。这些技术的发展为荧光检测技术降低了成本并提高了灵敏度。总体而言，蛋白质印迹的操作在不同检测方法之间是相似的，而荧光蛋白质印迹具有特定优势。

若要从荧光蛋白质印迹检测中获取最多信息，应对特定步骤进行优化，以限制和避免荧光污染。以下是进行荧光蛋白质印迹时可参考的一些小贴士。

在荧光蛋白质印迹检测中，选择适合的膜对于实现良好信噪比来说是至关重要的。背景荧光的一个主要来源是印迹膜。 当进行荧光蛋白质印迹检测时，尤其是当荧光基团的最大发射波长约为 488 nm时，需要使用具有低自发荧光的膜，包括硝酸纤维素膜和专门的低荧光 PVDF 膜。

荧光蛋白质印迹的主要优点之一是能够在单个印迹中显现多个蛋白质靶标。如今，凭借成像系统的最新技术，可以使用多达 4 种不同的荧光基团进行印迹检测。选择适合的二抗将更易于实现多重检测。以下是一些提示：

• 使用与其他物种高度交叉吸附的二抗，以避免交叉反应。
  • 交叉吸附的二抗为多克隆抗体，通过额外的纯化步骤进行制备，以过滤掉免疫球蛋白（IgG）有非特异性结合的抗体。该过程降低了物种的交叉反应性，增加了特异性。
• 使用来自不同宿主物种的一抗，避免交叉反应。最好使用来自两个远缘相关物种（例如大鼠和兔子）的抗体组合，避免使用类似小鼠和大鼠或山羊和绵羊的组合
• 致力于蛋白质印迹——严格验证的一抗。
• 如果不能进行物种分化，则使用直接与荧光基团结合的一抗
  （例如，内参对照、常见蛋白质靶标）
• 利用标签蛋白的优势，随时获得直标抗体
• 选择具有不同光学光谱的荧光基团，避免荧光通道的交叉。

多重印迹检测的示例。

许多封闭缓冲液可成功用于荧光蛋白质印迹（PBS、TBS、BSA、酪蛋白等）。洗涤和封闭缓冲液中的颗粒和污染物可沉淀在膜上并产生荧光伪影。我们建议仅使用高品质过滤缓冲液。

• 在封闭步骤中限制去垢剂的使用，因为常见去垢剂可自发荧光，通常会增加非特异性背景。封闭后，可以使用去垢剂。
• 如果从头开始制备缓冲液，请过滤灭菌。