Western Blot 蛋白质转印

湿式、半干式和干式转印方法比较

从凝胶到印迹膜，有效可靠的蛋白质转印是成功进行 Western Blot 实验的基础。结果的准确性取决于 Western Blotting 方法的转印效率。传统湿式转印法效率高，但费时费力。半干式印迹简便、省时，可以灵活使用多种类型的缓冲液系统或无缓冲液的预组装膜组。但是，半干式转印系统转印大分子量蛋白质 (>300 kDa) 的效率较低。干式电印迹无需添加缓冲液，所以既可提供高品质转印，又快速便捷。

将蛋白质从 SDS-PAGE 或天然凝胶转印到硝酸纤维素膜、PVDF 或尼龙膜上的三种主要方式：

• 湿式转印
• 半干式转印
• 干式转印

进行湿式转印时，首先在转印缓冲液中平衡凝胶。然后将凝胶放入“转印三明治”（滤纸-凝胶-膜-滤纸）中，加上衬垫，并用支撑格栅压在一起。将支撑好的转印三明治垂直放置在不锈钢/铂丝电极之间的槽中，并充满转印缓冲液。

可以使用标准电场选项，在恒定电流（0.1 至 1 A）或电压（5 至 30 V）下进行多块凝胶的电转印，耗时从 1 小时到整夜。通常使用冰袋或者冰块在 4℃ 下进行转印，以减少产生的热量。对于单块凝胶，可以使用高电场选项，使转印时间缩短至 30 分钟，但需要使用高电压（200 V 以内）或高电流（1.6 A 以内）以及冷却系统来消散产生的巨大热量。

对于 14-116 kDa 之间的蛋白质，转印效率可达 80-100%。转印效率随转印时间的增加而提高。但随时间的增加，存在蛋白质膜过度转印（穿过膜）的风险，尤其当使用较大孔径 (0.45 µm) 的膜处理分子量较低 (<30 kDa) 的蛋白质时。

对于半干式蛋白质转印，将转印三明治水平放置在半干式转印装置中的两个电极板之间。对于这种半干式转印，将凝胶在转印缓冲液中预先平衡至关重要。为了尽可能使流过凝胶的电流最大而不是凝胶周围的电流最大，转印过程中可用的缓冲液量应限制为转印三明治使用量，因此，如果将超厚滤纸（约 3 mm 厚）和膜也充分浸入缓冲液中，将有助于检测转印进行。另一关键点是将滤纸和膜剪切成与凝胶大小一致。

1-4 块凝胶可以快速转印到膜上。转印缓冲液可能包含甲醇，但不应使用其他有机溶剂，包括芳烃、氯代烃和丙酮，以免损坏半干式印迹装置。在恒定电流（0.1 至约 0.4 A）或电压（10 至 25 V）下进行电转印 10 至 60 分钟。建议使用无甲醇转印缓冲液，将转印时间缩短至 7 至 10 分钟。对于 14 至 116 kDa 之间的蛋白质，可以实现 60％ 至 80％ 的转印效率，转印更高分子量的蛋白质需要更长的转印时间。

干式印迹方法使用专门的含有创新成分的“转印三明治”，而不使用传统转印缓冲液。使用含缓冲液的独特凝胶基质（转印模组）代替缓冲液或浸湿的滤纸。凝胶基质中的高离子密度有助于实现蛋白质快速转印。在印迹过程中，铜阳极不会因水电解而产生氧气，降低了印迹变形。常规蛋白质转印技术（包括湿式和半干式）使用会产生氧气的惰性电极。通常，通过缩短电极之间的距离、施加高场强和大电流来缩短转印时间。