评估ELISA的加标，回收率和稀释线性度

加标和回收过程中，将已知量的分析物添加 (加标) 到天然供试样品基质中。然后，进行检测 (此处假设为 ELISA) 来测量加标样品基质的响应 (回收率) ，而标准稀释液中的相同加标物进行对比。

ELISA 方法涉及将供试样品与使用已知浓度的分析物 (例如纯化重组蛋白) 制备的标准曲线进行比较。检测优化的目的是尽可能提高信噪比，同时对标准稀释液 (标准曲线) 和样品基质 (生物样品 + 样品稀释剂) 中的给定分析物含量实现相同的反应。样品基质可能含有影响分析物检测对分析物响应的组分，不同于标准稀释液。加标和回收率实验设计用于评估检测反应的差异。

1. 将已知量的分析物添加到样品基质和标准品稀释液中。
2. 根据从标准曲线计算出的值对两组响应进行比较。
3. 如果观察到的加标回收率与标准稀释液中制备的分析物相同，则样品基质被认为对检测程序有效。如果回收率不同，则样品矩阵中的组份导致差异，必须对方法进行调整以将差异降至最低。

当加标和回收率实验检测到差异时，可以进行两种调整以重新优化 ELISA。

1. 改变标准品稀释液使用成分更与最终样品基质匹配的标准稀释液。例如，如果样本是培养上清液，则培养基可以用作标准稀释剂。如果之前对标准稀释液进行了信噪比优化，则更换稀释液以匹配样品基质性能将导致检测范围，灵敏度或信噪比降低。在某些情况下，可能需要做平衡。
2. 改变样品矩阵。如果使用了纯生物样品，则在标准稀释液或其他逻辑“样品稀释液”中稀释后重新测试该样品。例如，如果未稀释的血清样本产生的加标和回收率效果不佳，那么或许用标准稀释液 1 ： 1 稀释后的血清样本会更好地工作。如果稀释样品中的分析物水平足以被试验检测到，则该方法将纠正许多回收问题。

可以通过改变样品基质的 pH 值 (以匹配优化的标准稀释液) 或添加 BSA 或其他纯化蛋白作为载体 / 稳定剂来获得更好的结果。请注意，最佳样品稀释液不一定与最佳标准品稀释液相同。例如，血清样品含有大量背景蛋白 (例如白蛋白和免疫球蛋白)。但是，用作标准品的纯化重组蛋白可能不含任何载体蛋白。在这种情况下，最佳标准稀释液可能是含有 1% BSA 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) ，而血清的最佳样品稀释液可以是 PBS ，而无需任何额外蛋白。

稀释线性度实验提供了关于在所选样品稀释液中以不同稀释水平测试的样品结果精度的信息。线性是相对于基于标准曲线的分析物计算量来定义，而不是相对于原始吸光度测量值 (极佳拟合标准曲线通常不是线性)。

如果在较宽的稀释范围内具有良好的线性度，则该检测方法提供了分析不同浓度分析物的样品的灵活性 (即，可以将具有高浓度分析物的样品稀释几倍以确保其值位于标准曲线范围内，并与未经稀释测定的低水平样品进行比较)。

可通过以下两种方法，稀释线性度实验。

1. 传统方法。传统方法涉及使用含有已知分析物加标的低水平样品，然后在所选样品稀释液中检测该样品的几种不同稀释液。
2. 备选方法。另一种方法需要首先制备少量样品的几份稀释液，然后在测试前将相同量的分析物加标到每一份中。通过基于非加标和 / 或纯 (未稀释) 样品比较观察到的与预期值来评估检测回收率。

稀释线性差表明天然样品基质，样品稀释液和 / 或标准稀释剂对分析物的可检测性影响不同。这种差异可能是由于一种溶液中稀释的组分而导致的，与其他溶液相比，该溶液在检测方法中抑制或增强检测。因此，稀释线性不良的原因与加标和回收率不佳的同一原因有关。

这两种情况下的目标都是在标准稀释液和样品稀释剂之间保持平等。如有需要，可以使用加标水平，样品类型，样品稀释液和稀释因子的测试仪基质执行单次实验，同时评估加标和回收率以及稀释线性。

表 1.使用 Novex IL-1 beta ELISA 试剂盒 (人) 在九份人尿样中加标和回收重组人 IL-1 β。 µL µL 50 μ L 样本和 10 μ L 的加标储备液检测，得到预期的 0 ， 15 ， 40 或 80 pg/mL 加标浓度。加标样品的报告值反映了内源性 (无加标) 值的扣除。通过与加标稀释液对照的测得回收率进行比较，计算加标测试样品的回收率。稀释液对照品的稀释液，加标储备液和标准品的稀释液相同。所有值代表三个重复样品的平均值。

表2.总结加标和回收率结果的典型演示。 (表 1 中的数据。)

表3.使用 人 IL-1 β ELISA 试剂盒对三份人 IL-1 β 样品产生 ELISA 线性稀释结果。从上一项加标和回收率实验 (表 1 和 2) 中选择最佳样品稀释液，每个样品可稀释四份。评估观察到的值相对于由 IL-1 β 标准品产生的检测标准曲线。

1. John R. Crowther, Methods in Molecular Biology, the ELISA Guidebook.Second Edition.Humana Press, a part of Springer Science + Business Media, LLC 2009.
2. Butler J.E.The Behavior of Antigens and Antibodies Immobilized on a Solid Phase.In: M.H.V.Van Regenmortel, ed. Structure of Antigens.Boca Raton, FL: CRC Press, 1992: 209-259.Vol.1, 209; CRC Press, Inc.