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您的 ELISA 是否正常工作？可能的问题是什么？在运行 ELISA 时，有几个步骤可能会出现潜在问题并影响结果。下面列出了最常见的问题以及可能的解决方案。

探索不同的 ELISA 故障排除问题和潜在解决方案

问题：ELISA 中信号微弱或无信号
可能的原因溶液
试剂未在室温下
开始检测时		建议在开始检测前将所有试剂均置于室温下。让试剂在工作台上放置 15 – 20 分钟，达到室温。
组分存储不正确仔细检查试剂盒标签上的储存条件。大多数试剂盒需要在 2 –8oC 下储存
试剂过期确认所有试剂的有效期。请勿使用超过有效期的试剂。
试剂添加 / 制备不正确 检查方案，确保试剂按正确的顺序添加以及准备好进行正确稀释。
制备的稀释液不正确检查移液技巧—请参阅下文以及确认计算方式。
捕获抗体与板不结合
  • 如果使用即用型试剂盒：生产的试剂盒包括预包被捕获抗体的板子。
  • 如果使用抗体对试剂盒包被自己的板子：确保您使用的是 ELISA 板，而不是组织培养板。在 PBS 中稀释抗体。确保为包被和封闭步骤都提供正确的制备和孵育时间。
使用的检测抗体不足生产的试剂盒具有优化的实验方案。确保按照推荐的抗体稀释比例进行操作。如果使用抗体对试剂盒开发 ELISA ，可能需要优化检测。有关 更多信息，请参见 ELISA 开发和优化。
用移液器或洗涤吸头剐蹭孔板
将分液和吸液的移入和移出孔时要小心。自动洗板机可能需要校准，因此吸头不会接触孔底部。
在错误的波长上读取了板子生产的试剂盒已经经过的流程的优化。确保使用推荐的波长 / 滤光片。确保针对所使用的底物类型准确设置了微孔板读数仪。
问题：ELISA 中的信号过曝
可能的原因溶液
洗液不足使用适当的清洗程序—请参阅下文。在每个清洗步骤结束时，将板子倒置在吸水纸上，让其完全排干，如果需要，可以用力敲击以去除任何残留的液体。
未使用或重复使用封板膜孵育过程中，使用封板膜盖住检测板。每次打开孔板时使用新的封板膜。这将防止孔相互污染。
准备的稀释液不正确检查移液技术—请参阅下文以及检查计算结果。
长孵育时间比
推荐时长
生产的试剂盒已经经过的流程的优化。确保按照推荐的培养时间进行操作。如果开发使用抗体对的 ELISA ，可能需要优化检测。请参阅ELISA开发和优化以获取更多信息。
问题：ELISA 中背景高
可能得原因溶液
洗液不足
使用适当的清洗程序—请参阅下文。增加浸泡步骤的持续时间也可能有所帮助。每次让洗涤缓冲液浸泡时加入 30 秒。在每个清洗步骤结束时，将板子倒置在吸水纸上并让其完全排干，如果需要，可以用力敲打以去除任何残留的液体。
底物暴露于光下
优先使用		确保底物不暴露于光下—在黑暗环境中储存。进行检测时限制光暴露。
长孵育时间比
推荐时长
生产的试剂盒已经经过的流程的优化。确保遵循建议的培养时长。如果使用抗体对开发ELISA，您可能需要优化该检测方案。请参阅 ELISA 开发和优化 以获取更多信息。
标准曲线不好
制备的稀释液
检查移液技术—请参阅下文以及检查计算结果。
问题：ELISA 中的标准曲线差
可能得原因溶液
标准曲线不好
制备的稀释液
检查移液技术—请参阅下文以及检查计算结果。
捕获抗体没有
结合在板子上		确保您使用的是 ELISA 板，而不是组织培养板。在 PBS 中稀释抗体。确保包被和封闭步骤的正确制备和孵育时间。
问题：ELISA 中的重复数据不良
可能的原因溶液
洗液不足使用适当的清洗程序—请参阅下文。增加浸泡步骤的持续时间也可能有所帮助。每次让洗涤缓冲液浸泡时，都增加30秒。在每个洗涤步骤结束时，将板倒置在吸水纸上并允许其完全排干，如果需要，可以用力敲击以去除任何残留的液体。
捕获抗体未能
结合在板子上		确保您使用的是 ELISA 板，而不是组织培养板。在 PBS 中稀释抗体。确保为包被和封闭步骤都提供正确的制备和孵育时间。
未使用或重复使用封板膜孵育过程中，使用封板膜盖住检测板。每次打开孔板时使用新的封板膜。这将防止孔相互污染。
问题：ELISA 中检测间结果不一致
可能的原因溶液
洗液不足使用适当的洗涤程序 - 见下文。在每个洗涤步骤结束时，将板倒置在吸水纸上并允许其完全排干，如果需要，可以用力敲击以去除任何残留的液体。
不一致的孵育温度生产的试剂盒已经经过的流程的优化。确保遵循建议的培养温度。注意环境条件引起的温度波动。
未使用或重复使用封板膜孵育过程中，使用封板膜盖住检测板。每次打开孔板时使用新的封板膜。这将防止孔相互污染。
制备的稀释液不正确检查移液技术—请参阅下文以及检查计算结果。
问题：ELISA 的边缘效应
可能的原因溶液
温度不均匀
在孵育期间，采用封板膜完全密封板子。如果指示温度为 3 7o C ，确保培养板位于培养箱的中心。
蒸发在孵育期间，采用封板膜完全密封板子。
堆叠板避免孵育过程中把板子堆叠起来。
信号
问题：ELISA 中信号微弱或无信号
可能的原因溶液
试剂未在室温下
开始检测时		建议在开始检测前将所有试剂均置于室温下。让试剂在工作台上放置 15 – 20 分钟，达到室温。
组分存储不正确仔细检查试剂盒标签上的储存条件。大多数试剂盒需要在 2 –8oC 下储存
试剂过期确认所有试剂的有效期。请勿使用超过有效期的试剂。
试剂添加 / 制备不正确 检查方案，确保试剂按正确的顺序添加以及准备好进行正确稀释。
制备的稀释液不正确检查移液技巧—请参阅下文以及确认计算方式。
捕获抗体与板不结合
  • 如果使用即用型试剂盒：生产的试剂盒包括预包被捕获抗体的板子。
  • 如果使用抗体对试剂盒包被自己的板子：确保您使用的是 ELISA 板，而不是组织培养板。在 PBS 中稀释抗体。确保为包被和封闭步骤都提供正确的制备和孵育时间。
使用的检测抗体不足生产的试剂盒具有优化的实验方案。确保按照推荐的抗体稀释比例进行操作。如果使用抗体对试剂盒开发 ELISA ，可能需要优化检测。有关 更多信息，请参见 ELISA 开发和优化。
用移液器或洗涤吸头剐蹭孔板
将分液和吸液的移入和移出孔时要小心。自动洗板机可能需要校准，因此吸头不会接触孔底部。
在错误的波长上读取了板子生产的试剂盒已经经过的流程的优化。确保使用推荐的波长 / 滤光片。确保针对所使用的底物类型准确设置了微孔板读数仪。
问题：ELISA 中的信号过曝
可能的原因溶液
洗液不足使用适当的清洗程序—请参阅下文。在每个清洗步骤结束时，将板子倒置在吸水纸上，让其完全排干，如果需要，可以用力敲击以去除任何残留的液体。
未使用或重复使用封板膜孵育过程中，使用封板膜盖住检测板。每次打开孔板时使用新的封板膜。这将防止孔相互污染。
准备的稀释液不正确检查移液技术—请参阅下文以及检查计算结果。
长孵育时间比
推荐时长
生产的试剂盒已经经过的流程的优化。确保按照推荐的培养时间进行操作。如果开发使用抗体对的 ELISA ，可能需要优化检测。请参阅ELISA开发和优化以获取更多信息。
高背景
问题：ELISA 中背景高
可能得原因溶液
洗液不足
使用适当的清洗程序—请参阅下文。增加浸泡步骤的持续时间也可能有所帮助。每次让洗涤缓冲液浸泡时加入 30 秒。在每个清洗步骤结束时，将板子倒置在吸水纸上并让其完全排干，如果需要，可以用力敲打以去除任何残留的液体。
底物暴露于光下
优先使用		确保底物不暴露于光下—在黑暗环境中储存。进行检测时限制光暴露。
长孵育时间比
推荐时长
生产的试剂盒已经经过的流程的优化。确保遵循建议的培养时长。如果使用抗体对开发ELISA，您可能需要优化该检测方案。请参阅 ELISA 开发和优化 以获取更多信息。
标准曲线不好
制备的稀释液
检查移液技术—请参阅下文以及检查计算结果。
标准曲线不好
问题：ELISA 中的标准曲线差
可能得原因溶液
标准曲线不好
制备的稀释液
检查移液技术—请参阅下文以及检查计算结果。
捕获抗体没有
结合在板子上		确保您使用的是 ELISA 板，而不是组织培养板。在 PBS 中稀释抗体。确保包被和封闭步骤的正确制备和孵育时间。
复孔数据不好
问题：ELISA 中的重复数据不良
可能的原因溶液
洗液不足使用适当的清洗程序—请参阅下文。增加浸泡步骤的持续时间也可能有所帮助。每次让洗涤缓冲液浸泡时，都增加30秒。在每个洗涤步骤结束时，将板倒置在吸水纸上并允许其完全排干，如果需要，可以用力敲击以去除任何残留的液体。
捕获抗体未能
结合在板子上		确保您使用的是 ELISA 板，而不是组织培养板。在 PBS 中稀释抗体。确保为包被和封闭步骤都提供正确的制备和孵育时间。
未使用或重复使用封板膜孵育过程中，使用封板膜盖住检测板。每次打开孔板时使用新的封板膜。这将防止孔相互污染。
检测的差异性
问题：ELISA 中检测间结果不一致
可能的原因溶液
洗液不足使用适当的洗涤程序 - 见下文。在每个洗涤步骤结束时，将板倒置在吸水纸上并允许其完全排干，如果需要，可以用力敲击以去除任何残留的液体。
不一致的孵育温度生产的试剂盒已经经过的流程的优化。确保遵循建议的培养温度。注意环境条件引起的温度波动。
未使用或重复使用封板膜孵育过程中，使用封板膜盖住检测板。每次打开孔板时使用新的封板膜。这将防止孔相互污染。
制备的稀释液不正确检查移液技术—请参阅下文以及检查计算结果。
边缘效应
问题：ELISA 的边缘效应
可能的原因溶液
温度不均匀
在孵育期间，采用封板膜完全密封板子。如果指示温度为 3 7o C ，确保培养板位于培养箱的中心。
蒸发在孵育期间，采用封板膜完全密封板子。
堆叠板避免孵育过程中把板子堆叠起来。

ELISA 移液和洗涤技术技巧

移液技巧

  1. 使用符合制造商建议范围内的正确移液器
  2. 确认吸头已牢固地插与移液器上
  3. 确认移液时没有气泡
  4. 在每个标准品，样品或试剂之间更换吸头
  5. 每种试剂使用不同的储液槽
  6. 将样品吸取到孔的侧面，避免飞溅
  7. 始终进行样品 / 标准品复孔设置

洗涤流程

  1. 通过将吸头轻轻地降低到每个孔底部，完全吸液所有孔中的液体。
    备注：小心操作，不要划伤孔内侧。
  2. 用至少 400 μ L µL 的洗涤缓冲液填充孔
  3. 浸泡 15 到 30 秒
  4. 从孔中吸出洗涤缓冲液
  5. 按照提示重复方案 (通常 3-4 次)
  6. 清洗完成后，翻转孔板并在吸水组织上轻敲 (必要时用力) 干燥。确保清除所有残留的液体。
  7. 或者，也可使用洗瓶或自动洗板机。请务必 遵循上述内容。
     

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推荐阅读
  1. John R. Crowther, Methods in Molecular Biology, The ELISA Guidebook.Second Edition.Humana Press, a part of Springer Science + Business Media, LLC 2009.
  2. Butler J.E.The Behavior of Antigens and Antibodies Immobilized on a Solid Phase.In: M.H.V.Van Regenmortel, ed. Structure of Antigens.Boca Raton, FL: CRC Press, 1992: 209-259.Vol.1, 209; CRC Press, Inc.
  3. Lequin, Rudolf M. "Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)." Clinical chemistry 51.12 (2005): 2415-2418.

仅供科研使用，不可用于诊断目的。