ELISA (酶联免疫吸附测定) 是检测和定量特定蛋白质的有效方法。ELISA 通常需要捕获目标抗原或将其固定在固体表面上，然后与酶连接的抗体结合。通过与底物孵育来评估偶联酶的活性以产生可测量的产物，从而完成检测。ELISA 开发涉及选择规格，收集所需组份并构建工作方案。ELISA 优化涉及系统地调整和测试多种成分和变量，以帮助确保结果可靠和准确。以下图像提供了进行夹心 ELISA 的通用工作流程。
ELISA 的开发与优化

图1.典型 ELISA 方案的通用方案。

ELISA 开发

开发 ELISA 时需要考虑很多事情。第一种是使用 ELISA 不同方式—直接，间接或夹心法。不同方式的区别在于捕获和检测靶抗原的不同。直接和间接 ELISA 均将抗原固定在检测板上，然后使用标记的一抗 (直接) 或一抗和标记的二抗 (间接) 检测抗原。夹心 ELISA 被认为是最稳定的形式，因为抗原夹在两种一抗之间 (捕获和检测) ，然后使用标记的二抗 (或标记的链霉素亲和素，如果检测抗体被生物素化) 进行检测。 

以下视频描述了夹心式 ELISA 中的检测方法以及称为竞争性 ELISA 的完全不同的 ELISA 规格。

不同的 ELISA 规格具有不同水平的特异性，灵敏度，简单性和速度 (即步骤数量)。它们还需要不同数量和种类的组份。例如，夹心 ELISA 需要一对相互兼容的特异性抗体，称为抗体匹配的对。如果研究人员从头开始开发 ELISA ，通常是因为目标靶点是研究的 " 新 " ，在这种情况下，可能无法获得匹配的抗体对。可能需要定制抗体生产。

更详细地描述 ELISA 规格和 ELISA 的各种组分 (例如微孔板，洗涤缓冲液，封闭缓冲液，样品稀释剂， 酶偶联物和底物) ，请参阅 "ELISA 概述" 或我们的技术指南或手册之一。有关定制抗体生产的更多信息，请访问 我们网站上的定制抗体技术页面。

通常，除非有专门的研究需求需要新的 ELISA 开发，否则应检查商业 ELISA 试剂盒是否可用以检测目标靶标。我们提供 1,000 多种即用型 ELISA 试剂盒 ，这些试剂盒已经开发和优化以便专门检测靶标。试剂盒包括抗体预包被板和进行测定的其他组分。每个试剂盒都 经过验证和质量测试，因此无需自行优化步骤 (如下所述)。 使用 TNF α 比色 ELISA 试剂盒可产生以下代表性数据，用于检测小鼠 TNF α 小鼠重组蛋白。

通过 ELISA 检测重组小鼠 TNF α 蛋白

图2.通过 ELISA 检测重组小鼠 TNF α 蛋白。 使用小鼠 TNF α 比色 ELISA 试剂盒对小鼠 TNF- α 进行夹心式 ELISA 分析：每孔加载 50 ml 小鼠 TNF- α 重组蛋白 µg (溶于 2 ， 2450 ， 350 ， 50 和 0 pg/mL 的十二烷基化蛋白) ，覆盖 3 μ g/mL 大鼠抗小鼠 TNF- α 预包被板，并在室温下孵育 2 小时，每孔加入 50 ml 大鼠抗小鼠 TNF- α 生物素化抗体。洗涤板，在室温下以 1 ： 30 ， 000 的比例在所有检测孔中用 100 mL/ 孔链霉素亲和素 -HRP 孵育 30 分钟。使用 1-Step Ultra TMB 底物在室温下避光进行检测 30 分钟。然后用 0.16 M 硫酸停止平板。在酶标仪上读取吸光度，在 450-550 nm 下。

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ELISA 优化

一旦开发出可靠的 ELISA ，就可进行优化以提高其性能。下面提供了优化检测中每个组分的步骤—从捕获抗体到酶偶联物以及底物选择。这些步骤假设使用了夹心式 ELISA 形式。

优化中最重要的部分是检测不同浓度 (即稀释) 的抗体，样品和缓冲液。虽然每个组分都单独描述，但在许多情况下，可以通过执行棋盘滴定来同时优化两个组分，如下图所示。

同时优化两个 ELISA 参数的棋盘滴定实验示例

图3.使用棋盘格滴定实验的示例，可同时优化两个 ELISA 参数。该示例显示了一抗与所有其他试剂的检测抗体的比较。捕获和检测抗体进行优化后，可以滴定酶偶联物。

优化捕获抗体的浓度
  1. 在包被缓冲液中制备不同浓度的捕获抗体 (参见 下面表 1 中所述范围)。
  2. 向孔板上应用等体积的每种浓度，然后继续进行 ELISA 程序。
  3. 检查是否存在较强的信号与较低的背景。

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优化封闭液
  1. 制备不同的封闭溶液。如果封闭溶液未预配制 (即，它是单个蛋白，如 BSA) ，请尝试不同浓度的蛋白。
  2. 向孔板上应用等体积的每种浓度，然后继续进行 ELISA 程序。
  3. 检查是否存在较强的信号与较低的背景。
减小样品浓度。
  1. 尽量将标准稀释液与样品基质相匹配。如果矩阵本身不能完全复制，则测试不同的标准稀释液溶液。
  2. 将等体积的每种物质涂在板中，然后继续进行 ELISA 程序。
  3. 检查标准曲线的良好动态范围以及样品稀释的线性度。 
  4. 如果标准曲线的动态范围较差，则可能需要选择其他稀释液。如果样品稀释时稀释线性度较差，样品基质和标准稀释液之间可能会出现不平衡。在这种情况下，应进行加标和回收或稀释线性实验。
优化检测抗体的浓度
  1. 在标准稀释液中制备不同浓度的检测抗体 (请参阅 下面表 1 中所述范围)。
  2. 向孔板上应用等体积的每种浓度，然后继续进行 ELISA 程序。
  3. 检查是否存在较强的信号与较低的背景。

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优化酶偶联物的浓度
  1. 根据 表 2 中所述范围，在标准稀释液中制备不同浓度的酶偶联物。确保浓度与底物的描述范围一致。
  2. 向孔板上应用等体积的每种浓度，然后继续进行 ELISA 程序。
  3. 检查是否存在较强的信号与较低的背景。
优化信号检测
  1. 根据样品中可能量的抗原选择底物，并能够使用适当仪器检测。
  2. 将工作溶液应用于板上，然后继续执行 ELISA 方案。
  3. 如果抗原可以在动态范围内清晰地检测，则底物是合适的。如果抗原低于检测阈值，则选择一个更敏感的底物。
优化标准稀释液
  1. 根据 表 2 中描述的范围，在标准稀释剂中制备不同浓度的酶偶联物。确保浓度符合针对底物描述的范围。
  2. 向孔板上应用等体积的每种浓度，然后继续进行 ELISA 程序。

  3. 检查是否存在较强的信号与较低的背景。

下表提供了可用于确定最佳实验条件以优化 ELISA 结果的详细信息。需要考虑的参数包括抗体浓度，样品来源和所选酶系统

表 1.用于 ELISA 优化的包被和检测抗体的推荐浓度范围。 使用未纯化的抗体将有效，但可能导致更高的背景。通常建议使用亲和纯化抗体，以实现最佳信噪比。浓度仅为指南；为了获得最佳结果，单独优化每种组分。

Source（光源）包被抗体检测抗体
多克隆血清5-15 µg/mL1-10 µg/mL
粗腹水5-15 µg/mL1-10 µg/mL
亲和纯化多克隆1-12 µg/mL0.5-5 µg/mL
亲和纯化的单克隆细胞1-12 µg/mL0.5-5 µg/mL

表2.不同系统中 ELISA 的推荐酶偶联物浓度。有关酶偶联物的更明确浓度范围，请查看生产商的说明。 \

酶系统浓度
HRP比色系统20–200 ng/mL
 化学荧光系统25–50 ng/mL
 化学发光系统10–100 ng/mL
AP比色系统100–200 ng/mL
 化学发光系统40–200 ng/mL

推荐阅读

  1. John R. Crowther, Methods in Molecular Biology, the ELISA Guidebook.Humana Press, a part of Springer Science + Business Media, LLC 2009.
  2. Butler J.E.The Behavior of Antigens and Antibodies Immobilized on a Solid Phase.M.H.V.Van Regenmortel, ed. Structure of Antigens.Boca Raton, FL: CRC Press, 1992: 209-259.Vol.1, 209; CRC Press, Inc.
  3. 2415-2418. 

仅供科研使用，不可用于诊断目的。