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酶联免疫检测 (ELISA) 用于定量溶液中的特定蛋白质。检测酶可以通过多种方式加入试剂盒检测(图 1)。
辣根过氧化物酶 (HRP) 和碱性磷酸酶 (AP) 是最常用的酶标记物,主要是由于对 ELISA来说,选择范围很广。已使用的另一种酶标记是 β - 半乳糖苷酶 (β -Gal) ,但由于底物选项有限,并未广泛使用。
底物选择取决于所需的检测灵敏度和可用于信号检测的仪器(光吸收仪器、荧光仪器或发光仪器)。虽然不如荧光或化学发光底物敏感,但比色底物的使用更频繁;它们直接可视化并支持进行动力学研究。另外,使用标准吸光度板读数仪检测 ELISA 显色底物也是很多实验室的常见做法。
图 1.将 HRP 或 AP 等检测酶掺入 ELISA 的选项。 在检测中,目标抗原通过直接吸附到检测板进行固定化,或者首先将捕获抗体连接的孔板表面。然后可以使用酶偶联一抗(直接检测)或者匹配的一组未标记一抗和偶联二抗(检测检测)执行抗原检测。
在下面的 HRP 酶底物概述部分中了解有关这些产品的更多信息。
产品名称 | 优势、规格 | # 用于检测* | 吸收波长(nm)** | 颜色** | 检测限² | 推荐的一抗(1°)和二抗(2°)稀释液*** |
---|---|---|---|---|---|---|
TMB (3,3',5,5'-四甲基联苯胺) | ||||||
一步法Ultra TMB-ELISA底物溶液 | 最敏感的显色底物,即用型 | 2,500 孔 | 450 (650) | 黄色(蓝色) | 20 pg/mL | 1°—1:1,000
|
1-Step Turbo TMB-ELISA 底物溶液 | 在 5-30 分钟内快速检测 HRP 活性,即用型 | 2,500 孔 | 70 pg/mL | |||
1-Step Slow TMB-ELISA 底物溶液 | 动力学研究的理想底物,即用型 | 2,500 孔 | 80 pg/mL | |||
TMB 底物试剂盒 | 包括 TMB 溶液和过氧化物溶液 | 4,000 孔 | 60 pg/mL | |||
TMB 比色溶液 | 即用型规格 | 500 mL | ||||
ABTS (2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt | ||||||
1-Step ABTS 底物溶液 | 即用型规格 | 2,000 孔 | 410 (650) | 绿色 (不可见) | 2.5 ng/mL | 1°—1:1,000 2°—1:5,000 to 1:50,000 |
OPD(邻苯二胺二盐酸盐) | ||||||
OPD 底物 | 预称重片剂 | 50 片 | 490 (450) | 绿色(橙色) | 70 pg/mL | 1°—1:1,000 2°—1:5,000 to 1:50,000 |
粉末 | 25 g | |||||
* 参阅产品说明了解补充信息和确定检测次数。 | ||||||
** 吸光度波长 / 颜色格式,例如450 (650) 和黄色 (蓝色) - 第一个编号 / 颜色适用于停止的反应。( ) 中的数字和颜色表示非停止的反应。 | ||||||
** 检测限和建议抗体稀释度(基于1 mg/mL 储备液)是常规的优化手段。个别检测可能需要超出文中建议范围的条件。 |
在下面的 HRP 酶底物概述部分中了解有关这些产品的更多信息。
产品名称 | 优势、规格 | # 用于检测* | 发射最大波长(nm)** | 颜色 | 检测限*** | 一抗 (1°) 和二抗 (2°) 稀释液*** | 货号 |
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SuperSignal ELISA Pico 化学发光底物 | 快速生成信号, 5-30 分钟实现信号稳定;试剂盒含有过氧化物和增强剂溶液 | 1,000 孔 | 425 | 蓝色 | 5 pg/mL | 1° — 1 : 1 , 000 2° — 1 : 10 , 000 到 1 : 50 , 000 | 37070 |
2,500 孔 | 37069 | ||||||
SuperSignal ELISA Femto 底物 | 用于 ELISA 应用的最灵敏的底物之一;试剂盒含有过氧化物和增强剂溶液 | 1,000 孔 | 425 | 蓝色 | 1.7 pg/mL | 1° - 1 : 1 , 000 2° — 1 : 50 , 000 至 1 : 100 , 000 | 37075 |
2,500 孔 | 37074 | ||||||
* 基于96孔微孔板的检测总数。参阅产品说明了解补充信息和确定检测次数。 | |||||||
** 提供峰值发射波长供参考。但是,为了获得最佳灵敏度,请使用光度计测量总光输出。 | |||||||
*** 检测限和建议抗体稀释度(基于1 mg/mL 储备液)是常规的优化手段。个别检测可能需要超出文中建议范围的条件。 |
通过以下HRP 酶底物概述了解有关这些产品的更多信息。
产品名称 | 优势、规格 | # 用于检测* | Ex/Em 波长(nm)** | 检测限*** | 一抗 (1°) 和二抗 (2°) 稀释液*** | 货号 |
---|---|---|---|---|---|---|
动态范围较大 (4 log 过氧化物酶浓度范围) ;终点或动力学检测;试剂盒包含所有必要的试剂和缓冲液 | 2,700 孔 | 325/420 | 5 pg/mL | 1°—1:500 | 15169 | |
QuantaBlu NS/K 荧光底物试剂盒 | 针对动力学检测进行了优化;试剂盒包含所有必要的试剂和缓冲液 | 2,700 孔 | 325/420 | 1°—1:500 2°—1:5,000 to 1:20,000 | 15162 | |
QuantaRed 增强型化学荧光底物试剂盒 | 荧光或比色法读数;试剂盒包含所有必要的试剂和缓冲液 | 960 孔 | 570/585 | 4 pg/mL | 1°—1:1,000 2°—1:5,000 to 1:20,000 | 15159 |
Amplex Red 试剂 | 荧光或比色法读取。独立试剂 | 200 次检测 | 570/585 | 3.4 pg/mL | 1°—1:1,000 2°—1:5,000 to 1:20,000 | A12222 |
Amplex UltraRed 试剂 | 荧光或比色读取。独立试剂 | 3,400 次检测 | 570/585 | 3.4 pg/mL | 1°—1:1,000 2°—1:5,000 to 1:20,000 | A36006 |
*参阅产品说明了解补充信息和确定检测次数。 | ||||||
**Ex = 最大激发波长 (单位为 nm) ; Em = 最大发射波长 (单位为 nm)。 | ||||||
*** 检测限和建议抗体稀释度(基于1 mg/mL 储备液)是常规的优化手段。个别检测可能需要超出文中建议范围的条件。 | ||||||
† Amplex Red/UltraRed 终止试剂 (货号。A33855) 允许在用户确定的时间点终止荧光信号生成反应,更易于控制时间。 |
在下面的 HRP 酶底物概述部分中了解有关这些产品的更多信息。
产品名称 | 优势、规格 | # 用于检测* | 吸收波长(nm)** | 颜色** | 检测限² | 推荐的一抗(1°)和二抗(2°)稀释液*** |
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TMB (3,3',5,5'-四甲基联苯胺) | ||||||
一步法Ultra TMB-ELISA底物溶液 | 最敏感的显色底物,即用型 | 2,500 孔 | 450 (650) | 黄色(蓝色) | 20 pg/mL | 1°—1:1,000
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1-Step Turbo TMB-ELISA 底物溶液 | 在 5-30 分钟内快速检测 HRP 活性,即用型 | 2,500 孔 | 70 pg/mL | |||
1-Step Slow TMB-ELISA 底物溶液 | 动力学研究的理想底物,即用型 | 2,500 孔 | 80 pg/mL | |||
TMB 底物试剂盒 | 包括 TMB 溶液和过氧化物溶液 | 4,000 孔 | 60 pg/mL | |||
TMB 比色溶液 | 即用型规格 | 500 mL | ||||
ABTS (2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt | ||||||
1-Step ABTS 底物溶液 | 即用型规格 | 2,000 孔 | 410 (650) | 绿色 (不可见) | 2.5 ng/mL | 1°—1:1,000 2°—1:5,000 to 1:50,000 |
OPD(邻苯二胺二盐酸盐) | ||||||
OPD 底物 | 预称重片剂 | 50 片 | 490 (450) | 绿色(橙色) | 70 pg/mL | 1°—1:1,000 2°—1:5,000 to 1:50,000 |
粉末 | 25 g | |||||
* 参阅产品说明了解补充信息和确定检测次数。 | ||||||
** 吸光度波长 / 颜色格式,例如450 (650) 和黄色 (蓝色) - 第一个编号 / 颜色适用于停止的反应。( ) 中的数字和颜色表示非停止的反应。 | ||||||
** 检测限和建议抗体稀释度(基于1 mg/mL 储备液)是常规的优化手段。个别检测可能需要超出文中建议范围的条件。 |
在下面的 HRP 酶底物概述部分中了解有关这些产品的更多信息。
产品名称 | 优势、规格 | # 用于检测* | 发射最大波长(nm)** | 颜色 | 检测限*** | 一抗 (1°) 和二抗 (2°) 稀释液*** | 货号 |
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SuperSignal ELISA Pico 化学发光底物 | 快速生成信号, 5-30 分钟实现信号稳定;试剂盒含有过氧化物和增强剂溶液 | 1,000 孔 | 425 | 蓝色 | 5 pg/mL | 1° — 1 : 1 , 000 2° — 1 : 10 , 000 到 1 : 50 , 000 | 37070 |
2,500 孔 | 37069 | ||||||
SuperSignal ELISA Femto 底物 | 用于 ELISA 应用的最灵敏的底物之一;试剂盒含有过氧化物和增强剂溶液 | 1,000 孔 | 425 | 蓝色 | 1.7 pg/mL | 1° - 1 : 1 , 000 2° — 1 : 50 , 000 至 1 : 100 , 000 | 37075 |
2,500 孔 | 37074 | ||||||
* 基于96孔微孔板的检测总数。参阅产品说明了解补充信息和确定检测次数。 | |||||||
** 提供峰值发射波长供参考。但是,为了获得最佳灵敏度,请使用光度计测量总光输出。 | |||||||
*** 检测限和建议抗体稀释度(基于1 mg/mL 储备液)是常规的优化手段。个别检测可能需要超出文中建议范围的条件。 |
通过以下HRP 酶底物概述了解有关这些产品的更多信息。
产品名称 | 优势、规格 | # 用于检测* | Ex/Em 波长(nm)** | 检测限*** | 一抗 (1°) 和二抗 (2°) 稀释液*** | 货号 |
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动态范围较大 (4 log 过氧化物酶浓度范围) ;终点或动力学检测;试剂盒包含所有必要的试剂和缓冲液 | 2,700 孔 | 325/420 | 5 pg/mL | 1°—1:500 | 15169 | |
QuantaBlu NS/K 荧光底物试剂盒 | 针对动力学检测进行了优化;试剂盒包含所有必要的试剂和缓冲液 | 2,700 孔 | 325/420 | 1°—1:500 2°—1:5,000 to 1:20,000 | 15162 | |
QuantaRed 增强型化学荧光底物试剂盒 | 荧光或比色法读数;试剂盒包含所有必要的试剂和缓冲液 | 960 孔 | 570/585 | 4 pg/mL | 1°—1:1,000 2°—1:5,000 to 1:20,000 | 15159 |
Amplex Red 试剂 | 荧光或比色法读取。独立试剂 | 200 次检测 | 570/585 | 3.4 pg/mL | 1°—1:1,000 2°—1:5,000 to 1:20,000 | A12222 |
Amplex UltraRed 试剂 | 荧光或比色读取。独立试剂 | 3,400 次检测 | 570/585 | 3.4 pg/mL | 1°—1:1,000 2°—1:5,000 to 1:20,000 | A36006 |
*参阅产品说明了解补充信息和确定检测次数。 | ||||||
**Ex = 最大激发波长 (单位为 nm) ; Em = 最大发射波长 (单位为 nm)。 | ||||||
*** 检测限和建议抗体稀释度(基于1 mg/mL 储备液)是常规的优化手段。个别检测可能需要超出文中建议范围的条件。 | ||||||
† Amplex Red/UltraRed 终止试剂 (货号。A33855) 允许在用户确定的时间点终止荧光信号生成反应,更易于控制时间。 |
TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)可溶性底物检测 HRP 时会产生蓝色。它非常敏感,如果使用过多的蛋白质或抗体,可能会产生显著的背景信号。TMB 与其他 HRP 底物相比会被更快氧化,因此可以更快显色。
我们有不同的配方可供选择,具体取决于您的实验设计和灵敏度需求。
请参阅 图 2 了解不同配方和选择指南 (选项卡 1) 对您实验的最佳试剂盒的灵敏度范围的比较。
ABTS(2,2’-联氨-双-[3乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二氨盐)用于检测 HRP 并生成水溶性绿色反应终产物。
对于 HRP 检测,ABTS 灵敏度低于 OPD 和 TMB 底物。如果使用OPD或TMB底物由于灵敏度较高可能会导致高背景,但显色缓慢(约20分钟)可缓解此高背景。
ABTS 提供片剂或即用型。
OPD(邻苯二胺二盐酸盐)用于检测 HRP 并生成水溶性黄橙色反应产物。反应产物最大吸收波长为492 nm。
OPD 提供粉末或片剂形式,通过溶解于稳定的过氧化物底物缓冲液或过氧化氢缓冲液中可轻松制备。
图2.HRP 不同 TMB 比色 ELISA 底物的灵敏度比较。 TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)是 HRP 的常见显色底物,氧化后产生蓝色。然后,加入硫酸或磷酸(常用用于终止反应的溶液)后,颜色变为黄色。在左图中,在 ELISA 板检测中比较多个 TMB 底物的性能。
SuperSignal ELISA Pico 化学发光底物处理大量靶蛋白时性能卓越,容易优化,检测灵敏度高于入门级显色底物。快速生成信号,5-30分钟实现信号稳定,视 HRP 浓度而定(图3)。
SuperSignal ELISA Femto 最大灵敏度底物是可用于 ELISA 应用的最灵敏的底物之一。经过适当优化后,更低检测限为比常用显色底物低1到10个数量级。但是,未经过适当优化,蛋白质和酶容易导致高背景和负数结果。
图 3.使用 SuperSignal ELISA Pico 化学发光底物立即光产生。将生物素化 HRP 或生物素化 AP (200 pg) 添加至 NeutrAvidin 包被的白色聚苯乙烯板的单独孔中。然后在微孔板振荡器上于室温下 (RT) 孵育微孔板 30 分钟,然后用 BupH Tris 缓冲液 (货No. 28379).化学发光底物的工作溶液是根据制造商的说明制备的。SuperSignal ELISA Pico 化学发光底物号 37070) 和另一种基于鲁米诺的系统 (品牌 A) , µL 向适当的孔板中加入了 100 μ L 每种底物工作溶液。对于基于二氧环乙烷的系统,用 1X 检测缓冲液洗涤孔。接下来,将 100 μ L 二氧环乙烷工作溶液加入到 µL 孔板中。所有板在室温下孵育 1 分钟。然后在 DyneX MLX 微量滴定板化学发光分析仪上读取孔板,每孔读取时间为 0.2 秒。在 30 分钟的时间内进行了几次读数。
QuantaBlu荧光底物具有较宽的线性检测范围和检测HRP的低浓度线性。稳定的荧光反应产物的 Emax/Amax 为325 nm/420 nm,允许执行终止、非终止和动力学检测;优于更灵敏的化学发光底物。
QuantaRed 增强型化学荧光底物是可用于 HRP 检测的最灵敏的荧光 ELISA 底物。终止反应时,荧光反应产物(resorufin)可稳定4小时,Emax/Amax 为570 nm/585 nm。红移的resorufin反应产物允许在波长下进行检测,而生物样品中可能出现的自发荧光干扰较少。
Amplex Red 试剂 (10- 乙酰基 -3 , 7- 二羟基 吩嗪) 在存在辣根过氧化物酶的情况下与过氧化氢以 1 : 1 的化学计量比发生反应,生成高度荧光的试卤灵。该 HRP 酶底物具有更高的稳定性,产生更少的背景,并产生通过比色吸光度或荧光发射检测的红色荧光产物 (571/585 nm 的激发 / 发射波长)。
Amplex UltraRed 试剂改善了 Amplex Red 试剂的性能,在过氧化物酶或过氧化物酶偶联检测中,每一摩尔都能提供更亮的荧光和增强的灵敏度。被氧化的Amplex UltraRed试剂显示的荧光对于pH变化也很不敏感(图10.63)。在H2O2或硫醇(例如:二硫苏糖醇,DTT)存在条件下,与Amplex Red试剂相比较,由Amplex UltraRed试剂参与反应的底物和氧化产物显示出更大的稳定性。
Amplex Red/UltraRed 终止试剂 (货 No. A33855)允许在用户确定的时间点终止荧光信号生成反应,更易于控制时间。
PNPP (p-Nitrophenyl Phosphate, Disodium Salt) is a widely used substrate for detecting alkaline phosphatase in ELISA applications.PNPP 产生黄色的水溶性反应产物,可吸收405 nm 的光。PNPP 可提供结晶性粉末、5 mg 片剂或即用型等规格。
ONPG (邻硝基苯基 - β -D- 吡喃 半乳糖苷) 用于涉及 β - 半乳糖苷酶 (β -gal) 的 ELISA 应用。ONPG 产生完全可溶性黄色产物,其在 405 nm 处具有高消光系数。尽管存在其他 β -Gal 底物, ONPG 的高溶解度,易用工作流程和显著信噪比使其成为最理想的选择。
酶 | 底物 | 产品名称 | 优势、规格 | # 用于检测* | 吸收光波长(nm) | 颜色 | 检测限*** | Recommended primary (1°) and secondary (2°) antibody dilutions** | 货号 |
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Alkaline phosphatase (AP) | PNPP (p-Nitrophenyl Phosphate) | 1-Step PNPP 底物溶液 | 即用型规格 | 1,000 孔 | 405 | 黄色 | 100 ng/mL | 1°—1:500 2°—1:5,000 to 1:20,000 | 37621 |
PNPP 底物试剂盒 | 预先称重的片剂和缓冲液 | ~5,520 wells | |||||||
PNPP Tablets | Pre-weighed tablets | ~5,520 wells | |||||||
PNPP Powder | 25 g 粉末 | ||||||||
β - 半乳糖苷酶 (β -Gal) | ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside) | ONPG 底物 | 5 g 粉末 | 410 | 黄色 | 100 ng/mL | 1°—1:500 2°—1:5,000 | ||
* See product instructions for additional information and assay considerations that determine the number of assays. | |||||||||
** Detection limits and recommended antibody dilutions (based on 1 mg/mL stock) have been generalized as a starting point for optimization.Individual assays may require conditions outside the ranges suggested. |
使用二氧环乙烷的碱性磷酸酶底物可以根据其信号动力学—“辉光”底物和“闪光和辉光”底物分为 2 组。 有关两种底物及其反应的比较,请参见图 4。
增强剂可添加至检测中,以提高灵敏度和 / 或增加底物分解,从而产生非常快速的反应。在能够注入和读取参数的仪器中,可以 1 试剂 (单独底物) 或 2 试剂 (底物试剂加触发溶液) 的形式进样 1 , 2- 二氧六环烷,以在底物进样后秒至分钟内获得读数。
CSPD 和 CDP-Star 是化学发光的1,2-二氧杂环丁烷碱性磷酸酶底物,在475 nm波长处发出最大光强的光。这些底物是“闪光”底物,仅在 15-60 分钟后随时间提供持续的最大信号,具体取决于温度。以含水缓冲液形式(分别)提供5或25 mM。添加 Sapphire-II 或 Emerald-II 发光增强剂可以提高灵敏度。
CDP-Star 底物在溶液检测中可产生更高的信号。含有 Sapphire-II 或 Emerald-II 增强剂的 CDP-Star 底物产生的信号几乎是含增强剂的 CSPD 底物产生的信号的 5 倍。对于五倍的最大灵敏度, CDP-Star 底物溶液可提供极高的信号强度和极高的灵敏度。
图4.辉光,闪光和辉光底物的信号动力学比较。比较“辉光”和“闪光和辉光”底物配方的信号强度动力学 (图 A) 和信噪比 (图 B)。在 µg 微孔板中使用 20 μ L M-280 SA Dynabeads 磁珠检测 0.04 生物素 - 碱性磷酸酶。25°C 下的信号动力学显示了 " 辉光 " (即含 Emerald-II 增强剂的 CDP-Star 底物) 和 " 闪光和辉光 " (即含 RapidGlow 增强剂的 DynaLight Substrate) 底物,分别在 ~30 分钟和 ~5 – 10 分钟条件下达到最大光发射。
酶 | 底物 | 动力学信号类型 | 产品名称 | 优势、规格 | 数量 | 发射最大波长(nm)** | 检测限*** | 货号 |
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碱性磷酸酶 (AP) | 1 , 2- 二氧环乙烷 | 发光 | CDP-Star 底物 | 仅在 15-60 分钟后持续的最大信号,具体取决于温度 | 50 mL | 475 | pg-ng 范围 | T2145 |
250 mL | T2147. | |||||||
CDP-Star 底物,含 Sapphire-II 增强剂 | 用于基于溶液的试验 (即 ELISA) 中与 CSD STAR 底物配合使用;即用型 | 100 mL | 461 | pg-ng 范围 | T2214 | |||
含 Emerald-II 增强剂的 CDP-Star 底物 | 542 | pg-ng 范围 | T2216 | |||||
CSPD 底物 | 仅在 15-60 分钟后提供持续的最大信号,具体取决于温度。溶液测定中可以达到 10-20 分钟的峰值光发射 | 50 mL | 475 | pg-ng 范围 | T2141. | |||
100 mL | T2142. | |||||||
250 mL | T2143. | |||||||
CSDP 底物,含 Sapphire-II 增强剂 | 与基于溶液的试验 (即 ELISA) 中的 CSDP 底物配合使用;即用型 | 100 mL | 461 | pg-ng 范围 | T2210 | |||
含 Emerald-II 增强剂的 CSDP 底物 | 542 | pg-ng 范围 | T2212 | |||||
闪光和发光 | DynaLight Substrate with RapidGlow Enhancer | 可在 2-10 分钟内提供快速且持续的最大信号,具体取决于作为即用型溶液提供的温度 | 100 mL | ~1 pg/mL | 4475406 | |||
1 L | 4475410 | |||||||
* 提供峰值发射波长供参考。但是,为了获得最佳灵敏度,请使用光度计测量总光输出。 | ||||||||
** 检测限和建议抗体稀释度(基于1 mg/mL 储备液)是常规的优化手段。个别检测可能需要超出文中建议范围的条件。 |
如果您正在寻找 ELISA 实验所需的酶偶联物,赛默飞世尔科技还提供针对 ELISA 进行了二抗验证。请参阅以下链接的产品选择。我们还提供多种 亲和素和链霉亲和素酶偶联物。
酶 | 抗体酶偶联物 |
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辣根过氧化物酶(HRP)偶联物 | 选择 ELISA HRP 偶联二抗 了解更多有关 HRP 连接二抗的信息 |
碱性磷酸酶(AP)连接物 | 选择 ELISA AP 偶联的二抗 了解更多关于我们的碱性磷酸酶偶联的二抗信息 |
β - 半乳糖苷酶 (β -Gal) 偶联物 | 选择 ELISA β -Gal 偶联二抗 |
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