Western blot实验方案

Western blot 或蛋白质免疫印迹是一种常规蛋白分析技术。抗体-抗原相互作用的特异性实现了复杂蛋白质混合物中的靶蛋白识别。在这里，您可以获取常用的蛋白质电泳、western blot 缓冲液和保存液的详细配方，以及适用于化学发光和荧光法检测的通用蛋白质印迹方案，帮助您顺利完成实验。

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化学发光蛋白质免疫印迹实验方案

点击试剂配方标签页，查看推荐的缓冲液配方

实验材料

  • 硝酸纤维素或 PVDF 膜（例如，Thermo Scientific 印迹膜，货号88518，或其他同类产品）
  • 转印缓冲液（例如，NuPAGE 转印缓冲液，货号 NP0006，Novex Tris-甘氨酸转印缓冲液，货号 LC3675）
  • 漂洗缓冲液（含 0.05% Tween 20 的 Tris 缓冲液或磷酸缓冲盐，货号 28360 或 28352）
  • 封闭缓冲液（例如，Pierce 澄清牛奶封闭液，货号 37587）
  • 孵育托盘和容器
  • 一抗（例如，Invitrogen western blot 验证一抗）
  • 二抗（例如，Invitrogen western blot 验证 HRP 抗体）
  • 化学发光 HRP 底物（例如，SuperSignal West Pico PLUS 或 SuperSignal West Atto 极敏化学发光底物，货号 34580 或 A38555）

实验方案

  1. 根据所用蛋白凝胶体系，制备用于湿转或半干转的转印缓冲液。
  1. 准备转印膜（半干转或湿转转印）。按照生产商的说明书对转印膜进行预处理。
    • PVDF 膜：在甲醇或乙醇（100％）中预先润湿 30 秒钟，使用去离子水短暂漂洗，然后在转印缓冲液中平衡 5 分钟。
    • 硝酸纤维素膜：直接在转印缓冲液中平衡 5 分钟。
  1. 按照生产商的说明书进行湿转、半干转或干式转印。
  1. 蛋白转印结束后，将膜在去离子水中摇动漂洗 4 次，每次 5 分钟，以去除所有转印缓冲液。
  1. 室温下，使用足量封闭缓冲液摇动孵育膜 30–60 分钟。
  1. 按照供应商的建议，使用封闭缓冲液稀释一抗。

实验操作贴士

Thermo Scientific 化学发光底物的推荐一抗稀释范围。

 Pierce ECLSuperSignal West Pico PlusSuperSignal West DuraSuperSignal West FemtoSuperSignal West Atto
推荐一抗稀释范围1:1,000 (0.2–10 µg/mL)1:1,000 (0.2–1.0 µg/mL)1:5,000 (0.02–1.0 µg/mL)1:5,000 (0.01-0.2 µg/mL)1:5,000 (0.2–1.0 µg/mL)
  1. 将膜上结合蛋白的一面朝上置于一抗溶液中，在室温下摇动孵育 1 小时，或在 2–8℃ 下孵育过夜。确保抗体溶液可完全覆盖印迹膜。
  1. 使用漂洗缓冲液摇动漂洗膜共 3 次，每次 10 分钟。
  1. 使用适量漂洗缓冲液或封闭缓冲液稀释HRP二抗。

实验操作贴士

在步骤 8 中，如果使用的是直标一抗，请直接进行步骤 12。

Thermo Scientific 化学发光底物的推荐二抗稀释范围。

 Pierce ECLSuperSignal West Pico PlusSuperSignal West DuraSuperSignal West FemtoSuperSignal West Atto
推荐二抗稀释范围1:1,000 - 1:15,000 (0.07–1.0 µg/mL)1:20,000 - 1:100,000 (10–50 ng/mL)1:50,000 - 1:250,000 (4–20 ng/mL)1:100,000 - 1:500,000 (2–10 ng/mL)1:100,000 - 1:250,000 (4–10 ng/mL)
  1. 将膜上结合蛋白的一面朝上置于二抗溶液中，在室温下摇动孵育 1 小时。确保抗体工作液可完全覆盖印迹膜。
  1. 使用漂洗缓冲液摇动漂洗膜共 6 次，每次 5 分钟，以去除所有未结合的二抗。在这步操作中，是否对膜进行了充分的漂洗至关重要。
  1. 根据生产商的说明书制备化学发光底物的工作液。对于小型印迹，建议准备 8–10 mL 体积的底物工作液，对于中型印迹，建议准备 15 mL 体积的底物工作液（每 m2 的膜大约需要 0.1 mL 工作溶液）。
  1. 对于常规 ECL 底物，建议使用底物工作液孵育印迹膜 1 分钟，对于高性能底物，比如SuperSignal 底物，建议孵育 5 分钟。
  1. 将印迹膜从底物工作液中取出并去除多余的液体。
  1. 将印迹膜置于透明保鲜膜或文件保护膜上，使用气泡滚轮或玻璃移液管滚动以去除气泡。
  1. 使用胶片或适当的成像系统进行印迹成像。

荧光蛋白质免疫印迹实验方案

点击试剂配方标签页，查看推荐的缓冲液配方

实验材料

  • 硝酸纤维素膜或 PVDF 膜（例如，Thermo Scientific 印迹膜，货号22860，或其他同类产品）
  • 转印缓冲液（例如，NuPAGE 转印缓冲液，货号 NP0006，Novex Tris-Glycine 转印缓冲液，货号 LC3675）
  • 漂洗缓冲液（含 0.05% Tween 20 的 Tris 缓冲液或磷酸缓冲盐，货号 28360 或 28352）
  • 经预先过滤的封闭缓冲液（例如，Blocker FL 荧光封闭缓冲液，货号 37565）
  • 孵育托盘和容器
  • 一抗（例如，Invitrogen western blot 验证一抗）
  • 二抗（例如，Invitrogen 荧光标记的高度交叉吸附二抗）

实验方案

  1. 根据所用蛋白凝胶体系，制备用于湿转或半干转的转印缓冲液。
  1. 制备转印膜（半干式或湿转转印）。按照生产商的说明书对转印膜进行预处理。
    • PVDF 膜：在甲醇或乙醇（100％）中预先润湿 30 秒钟，使用去离子水短暂冲洗，然后在转印缓冲液中平衡 5 分钟。
    • 硝酸纤维素膜：直接在转印缓冲液中平衡 5 分钟。
  1. 按照生产商的说明书进行湿转、半干转或干式转印。
  1. 蛋白转印结束后，将膜在去离子水中摇动漂洗 4 次，每次 5 分钟，以去除所有转印缓冲液。
  1. 室温下使用足量封闭缓冲液摇动孵育膜 30–60 分钟。
  1. 按照供应商的建议，使用封闭缓冲液稀释一抗。
  1. 将膜上结合蛋白的一面朝上置于一抗溶液中，在室温下摇动孵育 1 小时，或在 2–8℃ 下孵育过夜。确保抗体溶液可完全覆盖印迹膜。
  1. 使用漂洗缓冲液摇动漂洗膜共 3 次，每次 10 分钟。如果使用荧光直标一抗，请直接进行步骤 11。
  1. 使用适量漂洗缓冲液或封闭缓冲液制备荧光二抗稀释液（0.4-0.1 µg/mL）。对于浓度为 2 mg/mL 的抗体储备液，可按 1:5,000-1:20,000 的比例稀释：
    • 1:5,000: 3 µL 二抗加至（15 mL 漂洗缓冲液）
    • 1:10,000: 1.5 µL 二抗加至（15 mL 漂洗缓冲液）
    • 1:20,000: 0.75 µL 二抗加至（15 mL 漂洗缓冲液）
  1. 将膜上结合蛋白的一面朝上置于二抗溶液中，在室温下孵育 1 小时并摇动。确保抗体溶液的体积足够完全覆盖印迹膜，防止强光照射导致荧光染料发生光漂白。
  1. 使用漂洗缓冲液摇动漂洗膜共 6 次，每次 5 分钟，以去除所有未结合的二抗。在这步操作中，是否对膜进行了充分的漂洗至关重要。
  1. 印迹可以在湿润时立即成像，也可以在干燥后再进行成像。成像之前，将每个印迹膜置于文件保护膜或清洁的表面上，以防污染。
  1. 使用具有荧光检测模式的成像系统对印迹进行成像。

实验操作贴士

实验操作贴士

切勿在封闭缓冲液中添加去垢剂，否则可能会增加背景荧光干扰。

使用常规孵育托盘时，小型印迹至少需要 15 mL 封闭液，中型印迹需要 30 mL 封闭液，确保液体完全覆盖转印膜。避免溶液体积过少，因为摇动时的溶液覆盖差异会导致背景过高或者不均匀。

实验操作贴士

可先在孵育托盘中使用蒸馏水反复加入和倾倒 4 次，然后再用漂洗缓冲液进行3次漂洗，每次 5 分钟，以缩短最终的漂洗步骤。

实验操作贴士

若要干燥印迹膜，将其置于两片 western blot 滤纸之间，防止干燥时暴露于光照下。干燥后的印迹膜可以保存更长时间，并缩短曝光时间。印迹需避光保存，防止发生光漂白。

Western Blot 缓冲液配方

储存液

  • 1 M Tris-HCl, pH 7.6 (100 mL)
  • 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 (100 mL)
  • 10% SDS (10 mL)
  • 1.0％ 溴酚蓝（10 mL）
  • 10X Tris 缓冲液（TBS）
  • 10X 磷酸盐缓冲液（PBS）

样品制备缓冲液

  • RIPA 裂解液
  • 2X Tris-Glycine SDS 上样缓冲液（Laemmli 缓冲液）
  • 4X LDS 上样缓冲液

电泳缓冲液

  • 10X Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液
  • 10X Tris-甘氨酸非变性电泳缓冲液
  • 20X MOPS SDS 电泳缓冲液
  • 20X MES SDS 电泳缓冲液
  • 10X Tricine SDS 电泳缓冲液

转印缓冲液

  • 25X Tris-Glycine 转印缓冲液
  • 20X Bis-Tris 转印缓冲液

漂洗缓冲液

  • 含 Tween 20 的 Tris 缓冲液（TBST）
  • 含 Tween 20 的磷酸盐缓冲液（PBST）

封闭缓冲液和抗体剥离液

  • 5% 脱脂牛奶
  • 3% BSA
  • 抗体剥离液

手灌胶配方

  • SureCast 试剂
  • 自选配胶试剂

储存液

1 M Tris-HCl, pH 7.6 (100 mL)

Tris Base12.11 g
去离子水80 mL
用 HCl 调节 pH 值至 7.6
去离子水至 100 mL

0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 (100 mL)

Tris Base6.06 g
去离子水60 mL
用 HCl 调节 pH 值至 6.8
去离子水至 100 mL

10% SDS（10 mL）

SDS1.00 g
去离子水至 10 mL

1.0％ 溴酚蓝（10 mL）

溴酚蓝100 mg
去离子水至 10 mL

10X Tris 缓冲液（TBS）

Tris Base24 g
NaCl88 g
去离子水900 mL
用 HCl 调j节 pH 值至 7.6
去离子水至 1000 mL

10X 磷酸盐缓冲液（PBS）

NaCl80 g
KCl2 g
Na2HPO414.4 g
NaH2PO42.4 g
去离子水900 mL
用 NaOH 调节 pH 值至 7.0
去离子水至 1000 mL

样品制备缓冲液

RIPA 裂解液：25 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% 脱氧胆酸钠, 0.1% SDS (100 mL)

NaCl0.88 g
NP-401 g
脱氧胆酸钠1 g
10% SDS1 mL
1 M Tris-HCl, pH 7.62.5 mL
去离子水至 100 mL
蛋白酶抑制剂片剂（货号 A32965）2 片

SDS 上样缓冲液（Laemmli 缓冲液）：63 mM Tris HCl、10% 丙三醇、2% SDS、0.0025% 溴酚蓝，pH 6.8（10 mL）

2X 储存液的配方：

0.5 M Tris-HCl pH 6.82.5 mL
甘油2 mL
10% (w/v) SDS4 mL
0.1%（w/v) ）溴酚蓝0.5 mL
去离子水至 10 mL

该缓冲液可在 4℃ 下稳定保存 6 个月。

LDS 上样缓冲液：106 mM Tris HCl、141 mM Tris Base、2% LDS、10% 丙三醇、0.51 mM EDTA、0.22 mM SERVA Blue G250、0.175 mM 酚红，pH 8.5。

4X 储存液的配方：

Tris HCl0.666 g
Tris Base0.682 g
LDS0.800 g
EDTA0.006 g
甘油4 g
SERVA Blue G250（1% 溶液）0.75 mL
酚红（1% 溶液）0.25 mL
去离子水至 10 mL

该缓冲液可在 4℃ 下稳定保存 6 个月。切勿使用酸或碱调整 pH 值。

电泳缓冲液

Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液：25 mM Tris Base、192 mM 甘氨酸、0.1% SDS、pH 8.3。

10X 储存液的配方：

Tris Base29 g
甘氨酸144 g
SDS10 g
去离子水至 1000 mL

Tris-甘氨酸非变性电泳缓冲液：25 mM Tris Base、192 mM 甘氨酸，pH 8.3。

10X 储存液的配方：

Tris Base29 g
甘氨酸144 g
去离子水至 1000 mL

MOPS SDS 电泳缓冲液：50 mM MOPS、50 mM Tris Base、0.1% SDS、1 mM EDTA，pH 7.7。

20X 储存液的配方：

MOPS104.6 g
Tris Base60.6 g
SDS10 g
EDTA3.0 g
去离子水至 500 mL

切勿使用酸或碱调节 pH 值。

MES SDS 电泳缓冲液：50 mM MES、50 mM Tris Base、0.1% SDS、1 mM EDTA，pH 7.3。

20X 储存液的配方：

MES97.6 g
Tris Base60.6 g
SDS10 g
EDTA3.0 g
去离子水至 500 mL

切勿使用酸或碱调节 pH 值。

Tricine SDS 电泳缓冲液：100 mM Tris Base、100 mM Tricine、0.1% SDS、pH 8.3。

10X 储存液的配方：

Tris Base121 g
Tricine179 g
SDS10 g
去离子水至 1000 mL

该缓冲液可在室温下稳定保存 6 个月。切勿使用酸或碱调节 pH 值。

转印缓冲液配方

Tris-甘氨酸转印缓冲液：12 mM Tris Base、96 mM 甘氨酸，pH 8.3。

25X 储存液的配方：

Tris Base18.2 g
甘氨酸90 g
去离子水至 500 mL

Bis-Tris 转印缓冲液：25 mM Bicine、25 mM Bis-Tris、1 mM EDTA，pH 7.2。

20X 储存液的配方：

Bicine10.2 g
Bis-Tris13.1 g
EDTA0.75 g
去离子水125 mL

该缓冲液可在 4℃ 下保持稳定 6 个月。
切勿使用酸或碱调节 pH 值。

漂洗缓冲液配方

含 Tween 20 的 Tris 缓冲液（TBST）

10X TBS100 mL
Tween 201 mL
去离子水至 1000 mL

含 Tween 20 的磷酸盐缓冲液（PBST）

10X TBS100 mL
Tween 201 mL
去离子水至 1000 mL

封闭缓冲液和抗体剥离液配方

5% 脱脂牛奶

脱脂奶粉2.5 g
TBST 或 PBST不超过 50 mL
过滤以去除未溶颗粒物 

3% BSA

BSA1.5 g
TBST 或 PBST不超过 50 mL
过滤以去除未溶颗粒物 

抗体剥离液

0.5 M Tris HCl, pH 6.812.5 mL
10% SDS20 mL
2-巯基乙醇0.8 mL
去离子水67.5 mL

手灌胶配方

使用 SureCast 试剂的手灌胶配方

根据下表制备分离胶。表中所列的体积可制备一块凝胶。根据需要制备的凝胶数量，成比例放大体积。

 聚丙烯酰胺浓度%
溶液4%6%8%10%12%14%16%18%20%
SureCast 预混丙烯酰胺（40%）0.8 mL1.2 mL1.6 mL2.0 mL2.4 mL2.8 mL3.3 mL3.6 mL4.0 mL
SureCast 分离胶缓冲液2.0 mL2.0 mL2.0 mL2.0 mL2.0 mL2.0 mL2.0 mL2.0 mL2.0 mL
蒸馏水5.1 mL4.7 mL4.3 mL3.9 mL3.5 mL3.1 mL2.7 mL2.3 mL1.9 mL
10% SureCast APS80 µL80 µL80 µL80 µL80 µL80 µL80 µL80 µL80 µL
SureCast TEMED*8 µL8 µL8 µL8 µL8 µL8 µL8 µL8 µL8 µL

*最后加入，并在倒胶之前充分混合

根据下表制备浓缩胶。表中所列的体积可制备一块凝胶。根据需要制备的凝胶数量，成比例放大体积。备注：溶液不需要脱气。

溶液4%
SureCast 预混丙烯酰胺（40%）0.30 mL
SureCast 浓缩胶缓冲液0.75 mL
蒸馏水1.92 mL
10% SureCast APS30 µL
SureCast TEMED*3 µL

*最后加入，并在倒胶之前充分混合

自选配胶试剂的配方

储存液

制备以下储存液：所有溶液均可室温保存。

50% 丙烯酰胺/BIS
（29:1）
  • 48.3 g 丙烯酰胺
  • 1.7 g BIS
加水定容至 100 mL。
在避光玻璃瓶中可稳定保存长达两个月。		分离胶缓冲液（1 M Tris-HCl，pH 8.8）
  • 将 30.3 g Tris 加入 150 mL 水中
  • 用 HCl 调节 pH 值至 8.8
加水定容至 250 mL。		浓缩胶缓冲液（0.375M Tris HCl，pH 6.8）
  • 将 11.4 g Tris 加入约 150 mL 水中
  • 用 HCl 调节 pH 值至 6.8
加水定容至 250 mL。		催化剂-过硫酸铵（使用当天新鲜配制）
  • 100 mg 过硫酸铵
加水定容至 2 mL。
10% SDS
  • 10.0 g SDS
加水定容至 100 mL。		50% 蔗糖
  • 50.0 g 蔗糖
加水定容至 100 mL。		  

分离胶

以下配方可制备约 25 mL 分离胶，足以用于灌制四块 1.0-mm 厚的小型凝胶 。根据需要制备的凝胶数量，成比例放大体积。

溶液6%凝胶8%凝胶10%凝胶12%凝胶14%凝胶16%凝胶18%凝胶20%凝胶
50% 丙烯酰胺/BIS3.0 mL4.0 mL5.0 mL6.0 mL7.0 mL8.0 mL9.0 mL10.0 mL
分离胶缓冲液9.4 mL9.4 mL9.4 mL9.4 mL9.4 mL9.4 mL9.4 mL9.4 mL
10% SDS250 µL250 µL250 µL250 µL250 µL250 µL250 µL250 µL
50% 蔗糖*4.0 mL4.0 mL4.0 mL4.0 mL4.0 mL4.0 mL4.0 mL4.0 mL
水7.8 mL6.8 mL5.8 mL4.8 mL3.7 mL2.7 mL1.7 mL750 µL
TEMED**6.25 µL6.25 µL6.25 µL6.25 µL6.25 µL6.25 µL6.25 µL6.25 µL
催化剂**625 µL625 µL625 µL625 µL625 µL625 µL625 µL625 µL

*可选，但建议使用，因为它有助于在分离胶和覆盖层之间形成理想的界面。如果忽略不用，则增加水量以补齐蔗糖溶液体积（基于上表数据增加 4.0 mL 水量）。
**最后加入，并在倒胶之前充分混合。

浓缩胶

以下配方可制备 4% 浓缩胶（12.5 mL）

溶液4%
50% 丙烯酰胺/BIS1.0 mL
浓缩胶缓冲液4.2 mL
10% SDS125 µL
水6.3 mL
TEMED*5.0 µL
催化剂*1.0 mL

*最后加入，并在倒胶之前充分混合。

化学发光检测

化学发光蛋白质免疫印迹实验方案

点击试剂配方标签页，查看推荐的缓冲液配方

实验材料

  • 硝酸纤维素或 PVDF 膜（例如，Thermo Scientific 印迹膜，货号88518，或其他同类产品）
  • 转印缓冲液（例如，NuPAGE 转印缓冲液，货号 NP0006，Novex Tris-甘氨酸转印缓冲液，货号 LC3675）
  • 漂洗缓冲液（含 0.05% Tween 20 的 Tris 缓冲液或磷酸缓冲盐，货号 28360 或 28352）
  • 封闭缓冲液（例如，Pierce 澄清牛奶封闭液，货号 37587）
  • 孵育托盘和容器
  • 一抗（例如，Invitrogen western blot 验证一抗）
  • 二抗（例如，Invitrogen western blot 验证 HRP 抗体）
  • 化学发光 HRP 底物（例如，SuperSignal West Pico PLUS 或 SuperSignal West Atto 极敏化学发光底物，货号 34580 或 A38555）

实验方案

  1. 根据所用蛋白凝胶体系，制备用于湿转或半干转的转印缓冲液。
  1. 准备转印膜（半干转或湿转转印）。按照生产商的说明书对转印膜进行预处理。
    • PVDF 膜：在甲醇或乙醇（100％）中预先润湿 30 秒钟，使用去离子水短暂漂洗，然后在转印缓冲液中平衡 5 分钟。
    • 硝酸纤维素膜：直接在转印缓冲液中平衡 5 分钟。
  1. 按照生产商的说明书进行湿转、半干转或干式转印。
  1. 蛋白转印结束后，将膜在去离子水中摇动漂洗 4 次，每次 5 分钟，以去除所有转印缓冲液。
  1. 室温下，使用足量封闭缓冲液摇动孵育膜 30–60 分钟。
  1. 按照供应商的建议，使用封闭缓冲液稀释一抗。

实验操作贴士

Thermo Scientific 化学发光底物的推荐一抗稀释范围。

 Pierce ECLSuperSignal West Pico PlusSuperSignal West DuraSuperSignal West FemtoSuperSignal West Atto
推荐一抗稀释范围1:1,000 (0.2–10 µg/mL)1:1,000 (0.2–1.0 µg/mL)1:5,000 (0.02–1.0 µg/mL)1:5,000 (0.01-0.2 µg/mL)1:5,000 (0.2–1.0 µg/mL)
  1. 将膜上结合蛋白的一面朝上置于一抗溶液中，在室温下摇动孵育 1 小时，或在 2–8℃ 下孵育过夜。确保抗体溶液可完全覆盖印迹膜。
  1. 使用漂洗缓冲液摇动漂洗膜共 3 次，每次 10 分钟。
  1. 使用适量漂洗缓冲液或封闭缓冲液稀释HRP二抗。

实验操作贴士

在步骤 8 中，如果使用的是直标一抗，请直接进行步骤 12。

Thermo Scientific 化学发光底物的推荐二抗稀释范围。

 Pierce ECLSuperSignal West Pico PlusSuperSignal West DuraSuperSignal West FemtoSuperSignal West Atto
推荐二抗稀释范围1:1,000 - 1:15,000 (0.07–1.0 µg/mL)1:20,000 - 1:100,000 (10–50 ng/mL)1:50,000 - 1:250,000 (4–20 ng/mL)1:100,000 - 1:500,000 (2–10 ng/mL)1:100,000 - 1:250,000 (4–10 ng/mL)
  1. 将膜上结合蛋白的一面朝上置于二抗溶液中，在室温下摇动孵育 1 小时。确保抗体工作液可完全覆盖印迹膜。
  1. 使用漂洗缓冲液摇动漂洗膜共 6 次，每次 5 分钟，以去除所有未结合的二抗。在这步操作中，是否对膜进行了充分的漂洗至关重要。
  1. 根据生产商的说明书制备化学发光底物的工作液。对于小型印迹，建议准备 8–10 mL 体积的底物工作液，对于中型印迹，建议准备 15 mL 体积的底物工作液（每 m2 的膜大约需要 0.1 mL 工作溶液）。
  1. 对于常规 ECL 底物，建议使用底物工作液孵育印迹膜 1 分钟，对于高性能底物，比如SuperSignal 底物，建议孵育 5 分钟。
  1. 将印迹膜从底物工作液中取出并去除多余的液体。
  1. 将印迹膜置于透明保鲜膜或文件保护膜上，使用气泡滚轮或玻璃移液管滚动以去除气泡。
  1. 使用胶片或适当的成像系统进行印迹成像。
荧光检测

荧光蛋白质免疫印迹实验方案

点击试剂配方标签页，查看推荐的缓冲液配方

实验材料

  • 硝酸纤维素膜或 PVDF 膜（例如，Thermo Scientific 印迹膜，货号22860，或其他同类产品）
  • 转印缓冲液（例如，NuPAGE 转印缓冲液，货号 NP0006，Novex Tris-Glycine 转印缓冲液，货号 LC3675）
  • 漂洗缓冲液（含 0.05% Tween 20 的 Tris 缓冲液或磷酸缓冲盐，货号 28360 或 28352）
  • 经预先过滤的封闭缓冲液（例如，Blocker FL 荧光封闭缓冲液，货号 37565）
  • 孵育托盘和容器
  • 一抗（例如，Invitrogen western blot 验证一抗）
  • 二抗（例如，Invitrogen 荧光标记的高度交叉吸附二抗）

实验方案

  1. 根据所用蛋白凝胶体系，制备用于湿转或半干转的转印缓冲液。
  1. 制备转印膜（半干式或湿转转印）。按照生产商的说明书对转印膜进行预处理。
    • PVDF 膜：在甲醇或乙醇（100％）中预先润湿 30 秒钟，使用去离子水短暂冲洗，然后在转印缓冲液中平衡 5 分钟。
    • 硝酸纤维素膜：直接在转印缓冲液中平衡 5 分钟。
  1. 按照生产商的说明书进行湿转、半干转或干式转印。
  1. 蛋白转印结束后，将膜在去离子水中摇动漂洗 4 次，每次 5 分钟，以去除所有转印缓冲液。
  1. 室温下使用足量封闭缓冲液摇动孵育膜 30–60 分钟。
  1. 按照供应商的建议，使用封闭缓冲液稀释一抗。
  1. 将膜上结合蛋白的一面朝上置于一抗溶液中，在室温下摇动孵育 1 小时，或在 2–8℃ 下孵育过夜。确保抗体溶液可完全覆盖印迹膜。
  1. 使用漂洗缓冲液摇动漂洗膜共 3 次，每次 10 分钟。如果使用荧光直标一抗，请直接进行步骤 11。
  1. 使用适量漂洗缓冲液或封闭缓冲液制备荧光二抗稀释液（0.4-0.1 µg/mL）。对于浓度为 2 mg/mL 的抗体储备液，可按 1:5,000-1:20,000 的比例稀释：
    • 1:5,000: 3 µL 二抗加至（15 mL 漂洗缓冲液）
    • 1:10,000: 1.5 µL 二抗加至（15 mL 漂洗缓冲液）
    • 1:20,000: 0.75 µL 二抗加至（15 mL 漂洗缓冲液）
  1. 将膜上结合蛋白的一面朝上置于二抗溶液中，在室温下孵育 1 小时并摇动。确保抗体溶液的体积足够完全覆盖印迹膜，防止强光照射导致荧光染料发生光漂白。
  1. 使用漂洗缓冲液摇动漂洗膜共 6 次，每次 5 分钟，以去除所有未结合的二抗。在这步操作中，是否对膜进行了充分的漂洗至关重要。
  1. 印迹可以在湿润时立即成像，也可以在干燥后再进行成像。成像之前，将每个印迹膜置于文件保护膜或清洁的表面上，以防污染。
  1. 使用具有荧光检测模式的成像系统对印迹进行成像。

实验操作贴士

实验操作贴士

切勿在封闭缓冲液中添加去垢剂，否则可能会增加背景荧光干扰。

使用常规孵育托盘时，小型印迹至少需要 15 mL 封闭液，中型印迹需要 30 mL 封闭液，确保液体完全覆盖转印膜。避免溶液体积过少，因为摇动时的溶液覆盖差异会导致背景过高或者不均匀。

实验操作贴士

可先在孵育托盘中使用蒸馏水反复加入和倾倒 4 次，然后再用漂洗缓冲液进行3次漂洗，每次 5 分钟，以缩短最终的漂洗步骤。

实验操作贴士

若要干燥印迹膜，将其置于两片 western blot 滤纸之间，防止干燥时暴露于光照下。干燥后的印迹膜可以保存更长时间，并缩短曝光时间。印迹需避光保存，防止发生光漂白。
试剂配方

Western Blot 缓冲液配方

储存液

  • 1 M Tris-HCl, pH 7.6 (100 mL)
  • 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 (100 mL)
  • 10% SDS (10 mL)
  • 1.0％ 溴酚蓝（10 mL）
  • 10X Tris 缓冲液（TBS）
  • 10X 磷酸盐缓冲液（PBS）

样品制备缓冲液

  • RIPA 裂解液
  • 2X Tris-Glycine SDS 上样缓冲液（Laemmli 缓冲液）
  • 4X LDS 上样缓冲液

电泳缓冲液

  • 10X Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液
  • 10X Tris-甘氨酸非变性电泳缓冲液
  • 20X MOPS SDS 电泳缓冲液
  • 20X MES SDS 电泳缓冲液
  • 10X Tricine SDS 电泳缓冲液

转印缓冲液

  • 25X Tris-Glycine 转印缓冲液
  • 20X Bis-Tris 转印缓冲液

漂洗缓冲液

  • 含 Tween 20 的 Tris 缓冲液（TBST）
  • 含 Tween 20 的磷酸盐缓冲液（PBST）

封闭缓冲液和抗体剥离液

  • 5% 脱脂牛奶
  • 3% BSA
  • 抗体剥离液

手灌胶配方

  • SureCast 试剂
  • 自选配胶试剂

储存液

1 M Tris-HCl, pH 7.6 (100 mL)

Tris Base12.11 g
去离子水80 mL
用 HCl 调节 pH 值至 7.6
去离子水至 100 mL

0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 (100 mL)

Tris Base6.06 g
去离子水60 mL
用 HCl 调节 pH 值至 6.8
去离子水至 100 mL

10% SDS（10 mL）

SDS1.00 g
去离子水至 10 mL

1.0％ 溴酚蓝（10 mL）

溴酚蓝100 mg
去离子水至 10 mL

10X Tris 缓冲液（TBS）

Tris Base24 g
NaCl88 g
去离子水900 mL
用 HCl 调j节 pH 值至 7.6
去离子水至 1000 mL

10X 磷酸盐缓冲液（PBS）

NaCl80 g
KCl2 g
Na2HPO414.4 g
NaH2PO42.4 g
去离子水900 mL
用 NaOH 调节 pH 值至 7.0
去离子水至 1000 mL

样品制备缓冲液

RIPA 裂解液：25 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% 脱氧胆酸钠, 0.1% SDS (100 mL)

NaCl0.88 g
NP-401 g
脱氧胆酸钠1 g
10% SDS1 mL
1 M Tris-HCl, pH 7.62.5 mL
去离子水至 100 mL
蛋白酶抑制剂片剂（货号 A32965）2 片

SDS 上样缓冲液（Laemmli 缓冲液）：63 mM Tris HCl、10% 丙三醇、2% SDS、0.0025% 溴酚蓝，pH 6.8（10 mL）

2X 储存液的配方：

0.5 M Tris-HCl pH 6.82.5 mL
甘油2 mL
10% (w/v) SDS4 mL
0.1%（w/v) ）溴酚蓝0.5 mL
去离子水至 10 mL

该缓冲液可在 4℃ 下稳定保存 6 个月。

LDS 上样缓冲液：106 mM Tris HCl、141 mM Tris Base、2% LDS、10% 丙三醇、0.51 mM EDTA、0.22 mM SERVA Blue G250、0.175 mM 酚红，pH 8.5。

4X 储存液的配方：

Tris HCl0.666 g
Tris Base0.682 g
LDS0.800 g
EDTA0.006 g
甘油4 g
SERVA Blue G250（1% 溶液）0.75 mL
酚红（1% 溶液）0.25 mL
去离子水至 10 mL

该缓冲液可在 4℃ 下稳定保存 6 个月。切勿使用酸或碱调整 pH 值。

电泳缓冲液

Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液：25 mM Tris Base、192 mM 甘氨酸、0.1% SDS、pH 8.3。

10X 储存液的配方：

Tris Base29 g
甘氨酸144 g
SDS10 g
去离子水至 1000 mL

Tris-甘氨酸非变性电泳缓冲液：25 mM Tris Base、192 mM 甘氨酸，pH 8.3。

10X 储存液的配方：

Tris Base29 g
甘氨酸144 g
去离子水至 1000 mL

MOPS SDS 电泳缓冲液：50 mM MOPS、50 mM Tris Base、0.1% SDS、1 mM EDTA，pH 7.7。

20X 储存液的配方：

MOPS104.6 g
Tris Base60.6 g
SDS10 g
EDTA3.0 g
去离子水至 500 mL

切勿使用酸或碱调节 pH 值。

MES SDS 电泳缓冲液：50 mM MES、50 mM Tris Base、0.1% SDS、1 mM EDTA，pH 7.3。

20X 储存液的配方：

MES97.6 g
Tris Base60.6 g
SDS10 g
EDTA3.0 g
去离子水至 500 mL

切勿使用酸或碱调节 pH 值。

Tricine SDS 电泳缓冲液：100 mM Tris Base、100 mM Tricine、0.1% SDS、pH 8.3。

10X 储存液的配方：

Tris Base121 g
Tricine179 g
SDS10 g
去离子水至 1000 mL

该缓冲液可在室温下稳定保存 6 个月。切勿使用酸或碱调节 pH 值。

转印缓冲液配方

Tris-甘氨酸转印缓冲液：12 mM Tris Base、96 mM 甘氨酸，pH 8.3。

25X 储存液的配方：

Tris Base18.2 g
甘氨酸90 g
去离子水至 500 mL

Bis-Tris 转印缓冲液：25 mM Bicine、25 mM Bis-Tris、1 mM EDTA，pH 7.2。

20X 储存液的配方：

Bicine10.2 g
Bis-Tris13.1 g
EDTA0.75 g
去离子水125 mL

该缓冲液可在 4℃ 下保持稳定 6 个月。
切勿使用酸或碱调节 pH 值。

漂洗缓冲液配方

含 Tween 20 的 Tris 缓冲液（TBST）

10X TBS100 mL
Tween 201 mL
去离子水至 1000 mL

含 Tween 20 的磷酸盐缓冲液（PBST）

10X TBS100 mL
Tween 201 mL
去离子水至 1000 mL

封闭缓冲液和抗体剥离液配方

5% 脱脂牛奶

脱脂奶粉2.5 g
TBST 或 PBST不超过 50 mL
过滤以去除未溶颗粒物 

3% BSA

BSA1.5 g
TBST 或 PBST不超过 50 mL
过滤以去除未溶颗粒物 

抗体剥离液

0.5 M Tris HCl, pH 6.812.5 mL
10% SDS20 mL
2-巯基乙醇0.8 mL
去离子水67.5 mL

手灌胶配方

使用 SureCast 试剂的手灌胶配方

根据下表制备分离胶。表中所列的体积可制备一块凝胶。根据需要制备的凝胶数量，成比例放大体积。

 聚丙烯酰胺浓度%
溶液4%6%8%10%12%14%16%18%20%
SureCast 预混丙烯酰胺（40%）0.8 mL1.2 mL1.6 mL2.0 mL2.4 mL2.8 mL3.3 mL3.6 mL4.0 mL
SureCast 分离胶缓冲液2.0 mL2.0 mL2.0 mL2.0 mL2.0 mL2.0 mL2.0 mL2.0 mL2.0 mL
蒸馏水5.1 mL4.7 mL4.3 mL3.9 mL3.5 mL3.1 mL2.7 mL2.3 mL1.9 mL
10% SureCast APS80 µL80 µL80 µL80 µL80 µL80 µL80 µL80 µL80 µL
SureCast TEMED*8 µL8 µL8 µL8 µL8 µL8 µL8 µL8 µL8 µL

*最后加入，并在倒胶之前充分混合

根据下表制备浓缩胶。表中所列的体积可制备一块凝胶。根据需要制备的凝胶数量，成比例放大体积。备注：溶液不需要脱气。

溶液4%
SureCast 预混丙烯酰胺（40%）0.30 mL
SureCast 浓缩胶缓冲液0.75 mL
蒸馏水1.92 mL
10% SureCast APS30 µL
SureCast TEMED*3 µL

*最后加入，并在倒胶之前充分混合

自选配胶试剂的配方

储存液

制备以下储存液：所有溶液均可室温保存。

50% 丙烯酰胺/BIS
（29:1）
  • 48.3 g 丙烯酰胺
  • 1.7 g BIS
加水定容至 100 mL。
在避光玻璃瓶中可稳定保存长达两个月。		分离胶缓冲液（1 M Tris-HCl，pH 8.8）
  • 将 30.3 g Tris 加入 150 mL 水中
  • 用 HCl 调节 pH 值至 8.8
加水定容至 250 mL。		浓缩胶缓冲液（0.375M Tris HCl，pH 6.8）
  • 将 11.4 g Tris 加入约 150 mL 水中
  • 用 HCl 调节 pH 值至 6.8
加水定容至 250 mL。		催化剂-过硫酸铵（使用当天新鲜配制）
  • 100 mg 过硫酸铵
加水定容至 2 mL。
10% SDS
  • 10.0 g SDS
加水定容至 100 mL。		50% 蔗糖
  • 50.0 g 蔗糖
加水定容至 100 mL。		  

分离胶

以下配方可制备约 25 mL 分离胶，足以用于灌制四块 1.0-mm 厚的小型凝胶 。根据需要制备的凝胶数量，成比例放大体积。

溶液6%凝胶8%凝胶10%凝胶12%凝胶14%凝胶16%凝胶18%凝胶20%凝胶
50% 丙烯酰胺/BIS3.0 mL4.0 mL5.0 mL6.0 mL7.0 mL8.0 mL9.0 mL10.0 mL
分离胶缓冲液9.4 mL9.4 mL9.4 mL9.4 mL9.4 mL9.4 mL9.4 mL9.4 mL
10% SDS250 µL250 µL250 µL250 µL250 µL250 µL250 µL250 µL
50% 蔗糖*4.0 mL4.0 mL4.0 mL4.0 mL4.0 mL4.0 mL4.0 mL4.0 mL
水7.8 mL6.8 mL5.8 mL4.8 mL3.7 mL2.7 mL1.7 mL750 µL
TEMED**6.25 µL6.25 µL6.25 µL6.25 µL6.25 µL6.25 µL6.25 µL6.25 µL
催化剂**625 µL625 µL625 µL625 µL625 µL625 µL625 µL625 µL

*可选，但建议使用，因为它有助于在分离胶和覆盖层之间形成理想的界面。如果忽略不用，则增加水量以补齐蔗糖溶液体积（基于上表数据增加 4.0 mL 水量）。
**最后加入，并在倒胶之前充分混合。

浓缩胶

以下配方可制备 4% 浓缩胶（12.5 mL）

溶液4%
50% 丙烯酰胺/BIS1.0 mL
浓缩胶缓冲液4.2 mL
10% SDS125 µL
水6.3 mL
TEMED*5.0 µL
催化剂*1.0 mL

*最后加入，并在倒胶之前充分混合。

技术指南

实验方案

技术指南

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