体内 RNAi 方案

有关体内实验的特殊考虑因素，请参阅以下补充方案。有关实验方案的问题，请联系 Invitrogen 技术支持部门，工作人员将派一位技术支持为您提供全程指导。

• 重悬 Stealth RNAi siRNA 以用于体内应用
• 测定 RNA 浓度
• 注射技术
• 采血
• 组织收获——RNA 提取
• 组织切片
• 组织蛋白提取
• 用于流式细胞分析的组织制备

体内纯度 Stealth RNAi siRNA 和 BLOCK-iT siRNA 双链经过专门配置以便用于动物。

将 RNA 双链重悬于不含 DNase/RNase 的超纯蒸馏水或不含 DNase/RNase 的合适缓冲液（如 PBS、Ringer 溶液、0.9% NaCl）中。推荐将 5 mg/ml 储备液用于体内 RNAi 实验。表1和表2详细说明体内纯度 Stealth RNAi siRNA 和 BLOCK-iT siRNA 的推荐重悬量。

表1.脱盐的纯度：最终浓度的推荐重悬量是 5 mg/mL 。

表2. HPLC 纯度：5mg/mL 最终浓度的推荐重悬量。

注：推荐重悬量适用于 GC 含量为 50% 的 RNAi 分子。根据 GC 含量，RNAi 分子的分子量略有不同，但这些区别可在体内 RNAi 实验中忽略不计。

如有需要，用 260 nm (A₂₆₀) 处的 UV 吸光度测量 RNA 浓度。在重悬缓冲液或水中稀释 RNA 溶液，然后混合均匀。在针对稀释缓冲液留白的分光光度计上测量稀释液的 A₂₆₀（使用光程长度为1 cm 的比色皿）。使用合适的公式计算 RNA 浓度：

Stealth RNAi siRNA
RNA 浓度 (μg/ml) = A₂₆₀（OD₂₆₀ 单位数）x 44（(μg/ml)/OD 单位）x 稀释因子

BLOCK-iT RNAi
RNA 浓度 (μg/ml) = A₂₆₀（OD₂₆₀ 单位数）x 41（(μg/ml)/OD 单位）x 稀释因子

注：Stealth RNAi siRNA 和 Block-iT siRNA 的公式因化学品和大小差异略有不同。

动物应按照国家法规进行处理和试验并经当地实验道德委员会批准。 处理动物的所有人都应接受当地机构的适当培训。在注射前给动物称重并在实验过程中保持体重记录。

小鼠注射位点

IP——腹腔内

限制小鼠并露出腹部。用酒精擦拭片擦拭注射部位以进行消毒，将针以45度角插入腹部并缓慢注射 (20 µl/sec)。

IV——静脉

应使用小鼠限制装置或向小鼠的下侧腹中注射麻醉剂来限制小鼠。或者，可以使用鼠尾注射限制器 (Braintree Scientific) 更好地显示鼠尾静脉并提高注射成功率。对注射部位进行消毒，然后稍微转动鼠尾以显示静脉。如需更好地显示静脉和扩张情况，请使用水浴或加热灯将静脉加热至 ~37º C。找到静脉后，对注射部位进行消毒并以小角度插入针。 缓慢注射 (~20 µl/sec) 并观察血液畅通情况。如果阻力增加且鼠尾上轻微隆起，请取下针，然后在上一部位附近重复该过程。完成后，取出针并按压注射部位。

IN——鼻内

为了进行此注射，应在小鼠的下侧腹中注射 0.2-0.3 ml 麻醉剂来麻醉小鼠。 将小鼠平躺放在加热垫上或加热灯下。使用 20 µl 移液器向每个鼻孔中注射 20 µl。缓慢注射，如果您观察到呼吸间隔缩短，在两次注射间等待1分钟以帮助恢复。

IT——瘤内

应使用小鼠限制装置或向小鼠的下侧腹中注射麻醉剂来限制小鼠。当皮下肿瘤部位的大小达到大约 3 ´ 3 mm² 时，小鼠已经做好注射准备。注射量通常为 0.5 µl/mm³。使用镊子固定肿瘤。 对注射部位进行消毒，将针直接插入肿瘤中，尽可能深地穿透但不会穿过肿瘤。将溶液缓慢推入肿瘤中。缓慢拉回针，但不要从肿瘤中拉出，改变针在肿瘤内的方向，然后推入。注射后，将针留在肿瘤约20秒，然后缓慢拉出并用细镊子夹住针口以免漏液。

采血方法取决于每个样品所需的血液量。如果需要几滴，将夹住尾巴。但是，如果需要较多血液或需要多次抽血，应在眼后或隐静脉抽血。

血清

应使用无热原/无内毒素的试管采集样品。全血应在室温下静置 15-30 分钟，以便凝固。在 4℃ 冷冻离心机中在 1,000–2,000 x g 下离心10分钟以分离细胞。用无菌巴斯德移液器将上清液转移到干净、冷却的聚丙烯管中。处理时，使样品保持 2-8°C。如果血清有待日后分析，将血清分成0.5 ml 等份试液并在 -80℃ 下储存。避免多次反复冻融。如果可能，避免使用溶血或有脂血症的血清。融化后，建议在分析前通过离心（14,000 rpm 下10分钟）和/或过滤来澄清样品，以防过滤板和/或探针堵塞。 按照试剂盒提供的测定程序进行适当的稀释。

血浆

在冷冻离心机中在 2,000 x g 下离心10分钟以便去除样品中的细胞。 必须在该力下离心以去除样品中的血小板。用无菌巴斯德移液器将上清液转移到干净、冷却的聚丙烯管中。处理时，使样品保持 2-8°C。 如果血浆有待日后分析，将其分成等份试液，装在聚丙烯微量离心管并在 -80℃ 下储存。避免多次反复冻融。分析准备就绪后，将样品置于冰上解冻。所有血浆样品应在分析前在冷冻微量离心机中通过离心（在 4℃ 下以 14,000rpm 离心10分钟）澄清。按照试剂盒提供的测定程序进行适当的稀释。

血液分析

从血液中提取 RNA 并使用 qRT-PCR 进行 siRNA 生物分布研究 Luminex 测定以测量 IFN 响应。

参考文献

1. Van Herck H, Baumans V, Brandt CJWM, Boere HAG, Hesp APM, Van Lith HA, Schurink M, Beynen AC (2001).Blood sampling from the retro-orbital plexus, the saphenous vein and the tail vein in rats: comparative effects on selected behavioural and blood variables.Laboratory Animals 35: 131-139.

1. 在4℃下，在 FastPrep- 24 仪器 (MP Biomedical) 上使用裂解基质 D 在 1 ml TRIzol 试剂中均质化 50-100 mg 组织。也可以使用组织均质器或定-转子。
2. 对于较硬组织（肿瘤、肺），在 6m/s 下执行3个周期，每周期60秒。对于较软组织（脑、肝），4.5m/s 下1个周期（60秒）足以完全解离组织。按照 PureLink Micro 至 Midi RNA 纯化系统手册所述的方案，直接向试管中加入0.2 ml 氯仿，然后进行操作。
3. 使用260 nm 处的 UV 吸光度或 Quant-iT RNA 测定试剂盒（货号 Q33140）或在琼脂糖 E 凝胶运行以测定纯化的 RNA 的质量和数量。
4. 定量后，使用 750 ng 总 RNA 以便使用 Superscript III RT 试剂盒进行第一链合成和使用 SYBR GreenER qPCR Super 混合液进行 QPCR 分析。

玻片准备

如果您正在准备您自己的玻片，使用 HistoGrip（Invitrogen 货号008050）或 0.1% 的多聚赖氨酸水溶液预包被玻片，然后风干。提供商用预包被玻璃玻片，其可用于装载冷冻或福尔马林固定石蜡包埋的组织切片。

冷冻组织

制备冷冻组织样品的方案示例请见下文，但仅有一个示例。如果实验室有针对您的样品类型优化的方案，请使用优化的方案。

将新鲜组织摁在含 OCT（最佳切割温度）化合物（含乙二醇和树脂的溶液，提供切片所用的惰性基质）的冷冻模具中。在 -70ºC 下储存冷冻组织块，直到您准备好进行组织切片。为了进行切片，让冷冻组织块平衡至冷冻温度，切割 4-20 µm 冷冻切片并放在包被的玻璃玻片上。在室温下干燥组织切片30分钟。如有需要，在固定前将玻片储存在 -70ºC 下。如果在 -70ºC 下储存玻片，请在固定步骤前将玻片加热至室温。将玻片置于 4ºC 的 100% 丙酮中10分钟以固定切片。从丙酮取出玻片并风干 10-30 分钟。使用 Mini PAP 触控笔圈出每个组织切片。在 -70ºC 下储存直至使用，或在 PBS 中洗涤玻片10分钟并染色或装片。

石蜡包埋切片——去除石蜡和复溶

为使用福尔马林固定石蜡包埋切片进行免疫组织化学染色，需要使用二甲苯去除石蜡，然后，在下面的示例方案中介绍的分级酒精系列中复溶。获取或制备所选的福尔马林固定石蜡包埋切片。将装有 4 µm 福尔马林固定石蜡包埋切片的玻片放入 55ºC 烘箱2小时或过夜（温度不得超过 60ºC）来进行干燥。将含有福尔马林固定石蜡包埋组织切片的玻片在室温下储存直到需要为止。在室温下将玻片放入二甲苯中5分钟。取出玻片，再次放入二甲苯中5分钟。取出玻片，放入 100% 乙醇中2次，每次5分钟。取出玻片，放入 95% 乙醇中5分钟。 取出玻片，放入 80% 乙醇中5分钟。取出玻片，放入 PBS 中10分钟。 拍打纸巾上玻片的边缘以去除多余的试剂并用实验室抹布擦净组织切片附近的区域。使用 Mini PAP 触控笔圈出每个组织切片。

样品制备

正确制备样品是 Western 印迹分析实验成功的关键。多重因素会影响样品制备方案的设计。由于不同细胞和组织中存在大量蛋白，因此无法制定适用于所有蛋白的一份样品制备方案。根据实验的起始材料和目标，需要根据经验确定样品制备方案。还可根据您的初始结果优化样品制备条件。如果实验室有针对您的特定样品的经优化样品制备方案，请使用优化的方案。下文提供了从不同来源制备样品的一般指导原则，还提供了示例程序。

哺乳动物组织样品

下文介绍了使用 1 ml 细胞提取缓冲液从 100 mg 组织中制备哺乳动物组织裂解物的方案。该方案适用于各种组织类型；某些组织可能需要进行一些优化。通常，将组织切成小片并将 100 mg 组织放入微量离心管中。加入含蛋白酶抑制剂混合物的 1 ml 细胞提取缓冲液。使用适合离心管的研杵研匀组织。将样品放在冰上孵育10分钟并间歇性旋晃。在 10,000 x g 下离心裂解物 5-10 分钟以去除任何颗粒材料。将上清液转移到无菌微量离心管中并分成等份试液，在估算蛋白后，继续制备 SDS-PAGE 样品，或在 -80ºC 下储存等份试液。如需更多详细信息，请参考试剂盒（货号 WFGE01）中的方案。

使用无创方法（如使用 CO₂ 进行过量麻醉）对小鼠实施安乐死。收集目标组织并将其放入低温 PBS 中。在装有 1-2ml 消化介质 (17703-034) 的 35mm 皮氏培养皿中用剃须刀片将组织切成 ~1mm3 的立方体。使用 5ml 移液器在每15分钟内上下孵育15到45分钟，具体取决于组织和移液器的硬度。孵育后，加入 4-5ml PBS 并使用极小的力过筛 (100um) 浆液，直至其穿过滤网进入 10ml 锥形管。用 PBS 洗涤细胞2至3次，方法如下：在 1,000g 下离心5分钟并丢弃每次洗涤后的上清液。 如果颗粒为深红色，PureLink 总 RNA 血液试剂盒 (K1560-01).中的红细胞裂解缓冲液 (L5) 洗涤颗粒。向细胞颗粒中 500ul L5。在冰上孵育10分钟。在孵育步骤中，短暂地旋晃试管 2-3 次，使红细胞完全裂解。溶液变为半透明。在 4°C 下以 400 x g 离心试管10分钟。完全去除上清液并丢弃上清液。 将细胞颗粒重悬于 PBS 中，然后继续洗涤。细胞颗粒应是白色，没有红色迹象。 将颗粒重悬于 0.5% PFA 中并在流式细胞分析前过筛 (50um)。

特殊说明和免责声明

介绍 siRNA 和修饰 siRNA 的体内递送的文献已经变得更加丰富。但是，所介绍的应用和方法往往不同。Invitrogen 在某种程度上提供在动物身上使用 siRNA 的一般指导原则，公司不保证在动物研究中使用这些产品或指导原则。