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RNAi实验对照
正确、适当的对照是确保每一次RNAi实验都能获得成功的基本前提。所选的对照数量和类型取决于最终的研究目标（参见下表）。我们提供了一系列RNAi技术选择，简化了对照反应，可协助研究人员鉴别并验证药物靶标、生成报告数据和申请授权。我们的RNAi对照使您可以：
- 判定哪一种RNAi分子可以呈递最佳的敲低效果
- 优化转染方案，实现更高的敲低效果
- 在实验早期确定细胞活力，节省不必要的时间
RNAi对照
| 对照类型 | 建议用途 |
|---|---|
| 转染对照 | 通过荧光计算和监测转染效率 |
| 阴性对照 | 用于测定相对本底敲低水平的非特异性RNAi对照；也可能是您的siRNA的序列打乱版本 |
| 阳性对照 | RNAi已知可实现较高的敲低水平；如果对其进行标记，可用于测定递送情况并优化实验条件 |
| 恢复实验 | 有助于确保表型是因为敲低感兴趣的基因而获得 |
| 附加RNAi对照指南 | 有关同一靶标的多个siRNA序列，RNAi滴度测定、未转染对照和下游对照的指南，请见后文。 |
在过表达实验下，即便是在低转染效率下往往仍能获得高得率结果。而如果要测定细胞群里的基因敲低效果，务必要实现尽可能高的转染效率。即便转染效率稍有下降，也可能导致您鉴别实验样本功能差异、通过qRT-PCR或免疫印迹分析验证敲低效果的能力受到限制。
为了实现尽可能高的转染效率——尤其是在基因敲低实验中——首先应优化您的细胞系的转染条件。此外，还必须要监测实验间的转染波动情况。
根据细胞类型和其他因素，共有几种转染试剂可选。您可以使用这些试剂和荧光标记的siRNA双链，监测转染效率。
阴性对照siRNA（不靶向任何基因产物的siRNA序列）是测定siRNA递送效果和为siRNA处理过的样本提供比较基准的必要前提条件。阴性对照有Silencer Select siRNA、Stealth RNAi™ siRNA和Silencer siRNA三类可供选择。 详细了解各种类型siRNA之间的差异.
我们建议每一次RNAi使用一种或多种阴性对照，您还应使对照siRNA与实验siRNA类型相匹配（例如，对于使用Silencer Select siRNA的实验，仅可使用 Silencer Select siRNA对照）。
Silencer Select阴性对照
两种Silencer Select阴性对照siRNA包含同一种旨在降低脱靶效应（在其他Silencer Select siRNA之中较为常见）的修饰，且无与小鼠、大鼠或人基因序列明显相似的序列。这一类阴性对照siRNA已经通过微阵列分析进行测试，结果表明其对基因表达的影响微乎其微。此外，这一类对照还采用多参数细胞检测实验进行过测试，结果证明其对待测细胞系的细胞增殖、活力或细胞形态无明显影响。
Stealth RNAi™ siRNA 阴性对照
对于使用Stealth RNAi™ siRNA的实验，我们已经预先设计出了具有以下特征的阴性对照：
- 三种水平的GC含量，以匹配三种实验用Stealth RNAi™ siRNA的GC含量：高、中等和低
- 与任何已知脊椎动物基因无同源性
- 针对多条双链进行过序列测试，未诱导产生应激反应
此外，您还可使用BLOCK-iT™ RNAi Designer选择任何Stealth RNAi™ siRNA序列的scrambled（序列打乱的）对照。我们的RNAi载体克隆试剂盒之中还随附一种阴性对照。这种阴性对照和靶标RNAi分子具有相同的化学结构。例如，如果您目前正在使用shRNA载体，则阴性对照应具有与之相同的载体骨架，但RNAi序列不同。 详细了解如何使用Stealth RNAi™ siRNA对照.
Silencer siRNA阴性对照
Ambion Silencer阴性对照siRNA无与小鼠、大鼠或人基因序列明显相似的序列。这一类对照经过细胞筛选法进行过测试，结果证明其对细胞增殖、活力或细胞形态无明显影响。
- 无靶向性，与已知基因相似的序列有限
- 经过了人、小鼠和大鼠细胞使用验证
- 经功能实验证明，对细胞增殖和细胞活力的影响微乎其微
- HPLC纯化，双链，可直接使用
阳性对照可帮助您确认实验条件可达到获取可靠数据的要求，让您对自己的RNAi对照试验结果更为自信。阳性对照为已知可以达到高敲低水平的siRNA分子(>70%)。阳性对照应用于优化siRNA递送条件，并重新验证各个RNAi实验的高递送水平。如果阳性对照未能产生预期的表型，则请仔细地评估您的实验条件，以便判定是否需要调整某些因素。典型的阳性对照实例为可轻松检测到表达水平的基因，例如 p53、lamin和GAPDH。阳性对照分Silencer Select siRNA、Stealth RNAi™ siRNA和Silencer siRNA三类可选择。详细了解不同类型的siRNA之间的差异.
您还应确保对照siRNA与实验用siRNA类型相对应（例如，在使用Silencer Select siRNA的试验中，仅可使用Silencer Select siRNA对照）。
Silencer Select siRNA阳性对照
Ambion Silencer Select阳性对照siRNA已经过反复验证，是很多siRNA试验理想的对照用品。
- 高级siRNA、高度纯化，可直接使用
- 已采用多种常用细胞系进行过功能测试
- 内含Silencer Select siRNA修饰，具有更强的特异性
- 可用于人、小鼠和大鼠细胞
Stealth RNAi™ siRNA阳性对照
Stealth RNAi™ siRNA阳性管家基因对照双链是RNAi试验是应用在RNAi试验中。作为对照物的理想选择，用于评估敲低效率、优化RNAi试验。这一类对照具有以下特征：
- 专用于有效敲低预定靶标
- 已经过反复测试，以即用形式供货
Silencer siRNA阳性对照
Ambion Silencer阳性对照siRNA最适于用于开发和优化siRNA试验。
- 经验证可用于优化siRNA试验的siRNA对照
- 基因特异性siRNA，随附序列打乱的阴性对照
- 已采用多种常用细胞系进行过功能测试
- HPLC纯化，双链，可直接使用
之所以进行RNAi恢复试验，是为了确认观测到的效果是由于靶标基因敲低造成的。如果您使用诱导型RNAi载体系统，则从培养基中去除四环素，关闭RNAi的表达。如果您使用Silencer Select siRNA或Stealth RNAi™ siRNA，则主要有两种方法来恢复表型。第一种方法包括设计靶向3’ UTR的RNAi序列，并在敲低之后采用表达感兴趣的基因的开放阅读框(ORF)的载体转染细胞；第二种方法的前提是RNAi序列设计用于ORF，您可以使用GeneArt基因合成试剂盒或一种诱变试剂盒，在RNAi序列靶向区域（最好是反义链的种子(seed)或切割区域（2-12碱基））内创造一个或多个沉默第三密码子点突变。
与其他靶标局部同源的siRNA序列可能会引起脱靶活性。基因表达谱试验已经证实，与其他转录本局部同源的双链复合物可以切割靶标，或者发挥类似于microRNA (miRNA)的作用，抑制靶标mRNA的翻译。某些研究证实，siRNA双链复合物可能会因靶标RNA的数量、位点、与靶标RNA错配的碱基对组成等而具有不同的活性。为了确保目标基因敲低能够引起特定的siRNA表型，应至少采用两种靶向靶标mRNA的非重叠区域的siRNA分子验证表型结果。因此，如果一种siRNA序列产生了特定的表型，而第二种siRNA序列（设计用于靶向同一靶标）产生了其他表型，则无法推断关注的基因被成功敲低。
siRNA滴度测定
Silencer Select siRNA和Stealth RNAi™ siRNA即便在低浓度下仍然非常有效，您应尽量使用最低效率水平，以免改变细胞的正常过程。滴定一定剂量的Silencer Select siRNA 和Stealth RNAi™ siRNA双链复合物，可以让您降低脱靶或非特异性效应，同时维持稳定的敲低效果。
下游对照
在转染细胞，执行qRT-PCR和免疫印迹分析以测定mRNA和蛋白表达水平之前，我们建议您验证自己的下游试剂。在使用您的细胞系进行敲低实验之前验证阳性对照和靶标基因的qRT-PCR引物和抗体，有助于确保您的试剂具有足够的灵敏度，可以检测到由于基因敲低引起的靶标基因表达变化。如果缺乏足够的灵敏度，则难以解读低表达水平基因或蛋白产生的敲低结果。
仅限研究用途，不可用于诊断操作。