RNAi 载体的慢病毒和腺病毒递送

经过不断发展，病毒可以将核酸有效递送到细胞，病毒成为接触难转染的细胞类型以便实现蛋白过表达或敲低的方法。腺病毒、致癌反转录病毒和慢病毒已经广泛用于在细胞培养和体内递送（表1）。

表1.为您的实验选择最佳的病毒系统。

腺病毒是可瞬时转导几乎任何哺乳动物细胞类型的 DNA 病毒。 腺病毒通过与腺病毒受体 (CAR)结合而进入靶标细胞。与 CAR 结合后，腺病毒通过整合素介导的内吞作用内化并主动转运到细胞核中以游离形式表达 DNA。

致癌反转录病毒和慢病毒是阳性链 RNA 病毒，它们将其基因组稳定整合到宿主细胞染色体中。通过趋向性广泛的包膜产生假型（如疱疹性口腔炎病毒糖蛋白 (VSV-G)），这些病毒几乎可以进入任何类型的哺乳动物细胞。然而，致癌反转录病毒在细胞分裂过程中依赖于细胞核膜分解来转导细胞。 相比之下，慢病毒是功能更多的工具，因为它们使用主动的细胞核导入通路来转导不分裂细胞。

对于许多疾病模型，最理想的细胞类型（如免疫系统或原代细胞）不易于转染。RNAi 载体的病毒递送是转染这些细胞类型和体内应用的强大替代方法。为了准确地测定细胞群内的 RNAi 载体的敲低效力，重要的是向尽可能多的细胞中递送 RNAi 载体。否则，当通过实时荧光定量 PCR (qRT-PCR) 或 Western 印迹分析来测量敲低效果时，非转染细胞中的 mRNA 或蛋白背景将使敲低效率低于实际情况。病毒递送可能是几乎任何哺乳动物细胞类型的最佳选择，包括难转染的原代细胞甚至不分裂细胞类型。通常，慢病毒递送系统可用于 shRNA 和 miR RNAi 载体，而腺病毒递送系统可用于 shRNA 载体（表2）。

使用 RNAi 病毒系统的程序（图1）：

1. 将对 shRNA 或 miR RNAi 编码的双链 DNA 寡核苷酸克隆成 BLOCK-iT 入门 (shRNA) 或表达 (miR RNAi) 载体之一。
2. 通过 Gateway 重组将 RNAi 盒转染成腺病毒（仅 shRNA）或慢病毒目的载体。
3. 将 RNAi 载体转染成病毒生产者细胞以生产病毒储备液，此储备液可立即使用或 –80°C 下储存
4. 收获病毒上清液并确定滴度（如有需要，增加腺病毒储备液）
5. 将慢病毒或腺病毒储备液转导成任何细胞类型

腺病毒和慢病毒表达系统产品手册列出生成和滴定腺病毒和慢病毒储备液的较详细方案。

成功转导的第一步是为您的实验目标选择系统（表1）。我们提供可克隆和生产腺病毒和慢病毒储备液的试剂盒，还提供克隆这些病毒载体并生产病毒储备液的服务。 BLOCK-iT Pol II miR RNAi 载体系统和 BLOCK-iT shRNA 载体系统不兼容，采用不同的慢病毒和腺病毒载体基质。 一旦您的慢病毒或腺病毒基质中存在 miR RNAi 或 shRNA 序列，两个载体系统按照相同的方案生产病毒储备液。

表2.选择慢病毒或腺病毒 RNAi 系统。