BLOCK-iT Pol II miR RNAi 表达载体试剂盒

与传统短发夹 RNA (shRNA) 载体相比，BLOCK-iT Pol II miR RNAi 表达载体（图1）具有显著优势。这些新型载体包括来自内源性 miRNA 的侧翼和环序列，其可指导从较长的 Pol II 转录物 (pri-miRNA) 中切除得到经基因改造的 miRNA。当细胞核内存在时，这些载体有效地使用内源细胞机器来处理采用特殊设计以便与目标序列 100% 同源的敲低序列并导致靶标切割（图2）。此外，循环序列具有独特的限制位点，因此可以进行线性化以提高测序效率，有时，也解决采用标准 shRNA 毛细管面临的挑战。

带 EmGFP 的 BLOCK-iT HiPerform 慢病毒 Pol II miR RNAi 表达系统是我们迄今为止提供的极强大、极灵活的 RNAi 载体。该技术兼具高滴度和极高表达能力。由于能够加入定制启动子，该系统适用于体内应用。

图 1.BLOCK-iT Pol II miR RNAi 表达载体 pcDNA 6.2-GW/miR 和 pcDNA 6.2-GW/EmGFP-miR 载体设计用于通过 microRNA 适应性基质中的核酸酶进行高效处理，以便表达作为 miRNA 的 RNAi 结构体（如 shRNA），此 miRNA 经基因改造以便与您的靶标序列 100% 同源进而导致靶标切割和沉默。
 

BLOCK-iT Pol II miR RNAi Designer 通过鉴定 miRNA 基因内的最佳靶标位点来诱导基因敲低，从而尽可能提高成功概率。该设计器提供了您杂交和克隆成 BLOCK-iT Pol II miR RNAi 表达载体所需的两个 DNA 寡核苷酸的序列。生产高效 miRNA 插入体的流程非常简单：

1. 选择 miR RNAi 设计选项。
2. 输入收录号或目标靶点的序列，设计器将生成高概率 DNA 双链，经过处理后，该双链与您的目标 100% 同源。
3. 每个 BLOCK-iT miR RNAi Select 发夹以装在单独试管中的两个 DNA 寡核苷酸的形式提供，可随时进行退火和克隆。杂交寡核苷酸以形成带 4-nt 5’突出端的 60-bp 双链。
4. 将双链粘连到线性化载体中。

了解 BLOCK-iT RNAi Designer 工具

您可以轻松确定表达目标 miRNA 的细胞。仅使用带 EmGFP 的 BLOCK-iT Pol II miR RNAi 表达载体试剂盒（Emerald 绿色荧光蛋白）或带 EmGFP 的 BLOCK-iT 慢病毒 Pol II miR RNAi 表达系统中的 pcDNA6.2 GW/EmGFP-miR 载体。由于 EmGFP 与您的目标 miRNA 进行共顺反子表达，您会发现 EmGFP 表达与 miRNA 的敲低活性基本 100% 相关（图 3a、b）。

图 3a. EmGFP 和 miRNA 表达 100% 相关。 Dra I 限制位点间带 EmGFP 以便轻松去除的 BLOCK-iT Pol II miR RNAi 表达盒图。
 

图 3b. EmGFP 和 miR RNAi 表达的 100% 跟踪。

使用预期效率为 50% 的 Lipofectamine 2000 试剂以 miR RNAi 靶向核纤层蛋白 A/C 转染细胞。48 小时后，使用对所有细胞（左图）染色的 Hoechst 细胞核染料对细胞进行处理，用红色核纤层蛋白 A/C 染料染色并监测 GFP 表达。近一半的细胞高度表达核纤层蛋白（中图）。当表达 EmGFP 和核纤层蛋白 A/C 的细胞结合时，很明显表达 GFP 的细胞似乎不会含有核纤层蛋白 A/C，针对核纤层蛋白 A/C 染成红色的细胞似乎没有任何 GFP 表达。这表明，由于存在共顺反子表达的 miR RNAi 结构体，表达 EmGFP 的细胞的核纤层蛋白表达显著减少。

BLOCK-iT Pol II miR RNAi 表达载体提供在单次试验中实现多次敲低的简单、有效方法。Pol II 启动子实现多个 miRNA 的共顺反子表达，让您能够敲低单个结构体中的多个靶标（图4）。通过使用简单的限制酶程序，您可以任意顺序链接两个或多个 miRNA 序列。这非常适合敲低您的细胞类型的多个通路成分敲低或剪接变体或者使用敲低表达合成表型。

Pol II 启动子灵活性允许组织特异性表达
大多数 shRNA 载体由 Pol III 启动子驱动，这极大地限制了可在 RNAi 实验中使用的启动子的类型并使得无法在体内系统中实现组织特异性表达。其他载体方法使用经过特殊修饰的 Pol II 启动子，它们无法方便地交换。BLOCK-iT Pol II miR RNAi 表达载体含有 CMV 立即早期 Pol II 启动子并且兼容几乎其他任何 Pol II 启动子（图5），这提供一个灵活系统来调节敲低或使用在特定目标组织中活跃的启动子进行体内研究。在 RNAi 手册的第 8 章了解我们载体的更多详细信息。 

B                                                                                                C

带 EmGFP 的 BLOCK-iT 诱导 Pol II miR RNAi 表达载体试剂盒让客户能够调节 RNAi 实验（见图6）。现在，您可以通过诱导系统控制 RNAi 反应的开始来观察随时间发生的变化。该试剂盒含有 pT-REx-DEST30 Gateway 载体，在简单克隆和穿梭技术后，该载体产生适用于诱导型敲低的 miR RNAi 表达载体。pT-REx-DEST30 Gateway 载体包含带有两个四环素操纵基因 (tetO2) 序列拷贝的 CMV 启动子，实现高水平和调节表达。这允许在稳定转染细胞系中进行功能丧失研究，即使目的基因是必需的也可进行研究。此外，在基因功能恢复期间，可以停止 miR RNAi 表达的诱导，因此可以测量表型变化。

Gateway 技术提供通过同源重组将您的 miRNA 盒转染成各种载体的快速、有效方法（表1）。使用 BLOCK-iT Pol II miR RNAi 表达载体试剂盒，将 miRNA 直接克隆成 Gateway 表达载体而不是 Gateway 入门载体。因此，pcDNA6.2-GW/miR 和 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR 表达载体与典型 Gateway 入门载体有两个主要区别（图7）：

1. miRNA 表达载体含有 CMV 启动子。一旦克隆了您的 miRNA 序列，您就可以立即转染并获得您的 miRNA 表达。
2. attB 位点在 miRNA（和 GFP 序列，如果使用 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR）侧翼。对于在不同 DEST（目标）载体中表达，必须先将插入体转染成 pDONR（供体）载体，然后通过双 Clonase 反应（pDONR 221 载体、BP 和 LR Clonase II 酶混合物和 pLenti6/V5-DEST 载体均在 BLOCK-iT 慢病毒 Pol II miR RNAi 表达系统中提供）转染成所选 DEST 载体。

您可以避免耗时且繁琐的亚克隆程序并轻松迁移至尽可能多的 DEST 载体（与您想要使用 Gateway 重组时一样）。

表1.Gateway 目的载体兼容性

表1.各种 Gateway 目的载体均经过与 BLOCK-iT Pol II miR RNAi 表达载体试剂盒兼容性的功能测试，以便通过同源重组轻松转染您的 miRNA 盒。

BLOCK-iT 和 BLOCK-iT HiPerform 慢病毒 Pol II miR RNAi 表达系统兼具 BLOCK-iT Pol II miR RNAi 表达载体试剂盒与 Virapower 慢病毒表达载体的所有优点，能够将经基因改造的 miRNA 稳定递送到不分裂、原代和难以转染的细胞中。例如，ViraPower 慢病毒表达载体已用于将 miRNA 序列递送到 HeLa 细胞以便敲低核纤层蛋白 A/C 或 lacZ（图8）。使用此系统，您将在您选择的细胞模型系统中实现 miRNA 的长期、稳定表达。

HiPerform 载体（图9）含有一个 mRNA 稳定序列 (WPRE) 和一个核导入序列 (cPPT)，它们已在许多细胞系中实现高达5倍的病毒滴度和 EmGFP 表达水平（图10）。此外，MultiSite 技术允许您表达 CMV、EF-1a 或您自己的组织特异性或其他体内合适的启动子中的 EmGFP/miR RNAi 盒。

• 滴度高达5倍（通过 GFP 测量）以便转导更多细胞或采用更高的感染倍数 (MOI)
• 加入您自己的组织特异性或其他体内合适的启动子 
• 使用 EmGFP 通过共顺反子表达来跟踪 miRNA 的表达 
• 通过单个转录物中多个 miRNA 的表达同时敲低多个基因