质粒 DNA 转染的优化

对于任何转染程序，关键的第一步是优化转染条件。每个细胞类型和转染程序都有一套关于最佳导入外源 DNA 的典型要求，即使在彼此非常相似的细胞类型中，这些条件也具有很大程度的变异性。

优化转染效率时最重要的一个因素是为细胞类型选择合适的转染方案。选择合适的转染方法后，可以利用瞬时报告基因试验系统通过以下方式优化程序：在多种条件下转染一个报告基因，并通过检测报告基因产物来监测转染效率。

本部分为磷酸钙介导的基因转移、使用 Neon® 转染系统进行的电穿孔和阳离子脂质体介导的转染提供了一般优化指南。

影响磷酸钙转染效率的主要因素是磷酸钙-DNA 共沉淀物中的 DNA 量、细胞与共沉淀物孵育的时长以及甘油或 DMSO 休克的使用和持续时间。

磷酸钙转染中使用的总 DNA 量通常为 10-50 μg（溶于 450 μL 无菌水和 50 μL 2.5 M CaCl₂/10 cm 培养皿），但各质粒制备物以及不同细胞和培养基之间差异很大。对于一些细胞系，将 10-15 μg 的 DNA 加入到 10 cm 培养皿中会导致过多细胞死亡且 DNA 摄取量极少，而其他细胞系则需要较高浓度的 DNA，原代细胞尤其如此。应针对每种新的质粒制备物和要转染的每种新细胞系检测最佳 DNA 浓度。

细胞与共沉淀物孵育的最佳时长也因细胞类型而异。一些适应力强的细胞类型（如 HeLa、NIH 3T3 和 BALB/c 3T3）通过与共沉淀物孵育长达16小时可得到有效转染，但该孵育时长可能会杀死一些更敏感的细胞。

通过改变 DNA 量、孵育时间以及甘油或 DMSO 休克暴露条件进行预试验，可以确定所用细胞类型是否能够耐受长时间暴露于磷酸钙沉淀物，以及是否应使用甘油休克。获得预试验结果后，可通过更精细地调整实验变量而进一步优化。例如，如果用 10% 甘油休克处理细胞3分钟（示例如下）可增强转染效率，则也可以尝试改变甘油休克处理的时间或改为使用 10%-20% DMSO 进行实验。

表1：优化磷酸钙共沉淀转染的预试验示例

使用阳离子脂质体成功转染 DNA 受到4个主要参数的影响：DNA 量、转染试剂与 DNA 的比例、脂质体-DNA 复合物的孵育时间以及加入复合物时的细胞密度。应对每种细胞类型和载体组合的这些因素进行系统评估，并且优化后应在未来的所有实验中保持恒定，以确保获得可重现的结果。

为获得最佳结果，请遵循试剂生产商提供的优化方案。

图1：使用 Lipofectamine® 3000 转染试剂转染的操作流程示例。

电穿孔主要取决于三个电参数的组合：脉冲电压、脉冲宽度和脉冲数。也许因为电穿孔不是化学转染方案，其受 DNA 浓度的影响较小；然而，该方案所需的细胞和 DNA 量几乎是磷酸钙介导转染的5倍。一般而言，1-5 μg DNA/10⁷ 个细胞已足够，存在的 DNA 量与摄取量呈良好的线性相关性。

优化电穿孔参数的目的是找到可维持细胞 40%-80% 存活率的脉冲条件。脉冲宽度由电源电容决定，具体取决于产生脉冲的电源的电子器件。如果发生过多细胞死亡，可以通过降低电容来缩短脉冲长度。

将细胞置于冰上通常可改善细胞活力并实现更高的有效转染频率，尤其是在可产热的高功率条件下（Potter 等人，1984）。然而，一些细胞系在室温低电压/高电容条件下的电穿孔效率更高（Chu 等人，1991）。

Life Technologies™ 提供的 Neon® 转染系统有18孔和24孔预设置优化方案，允许在数天内快速优化多种贴壁细胞系和悬浮细胞系的电参数。对于许多常用细胞类型，也可直接下载供 Neon® 转染系统使用的细胞系专用优化方案，以最大限度地提高转染效率。