质粒 DNA 转染指南

经典转染技术最初是为了将质粒 DNA 导入细胞而开发，质粒 DNA 目前仍是最常用于转染的载体。可将含有重组基因和调控元件的 DNA 质粒转染入细胞，以研究基因功能和调控，进行基因产物的突变分析和生化表征，研究基因表达对细胞健康和生命周期的影响，以及大规模生产蛋白质用于纯化和下游应用。

载体构建体的拓扑结构（线性或超螺旋）和大小、质粒 DNA 的质量以及启动子的选择是影响质粒 DNA 转染效率的主要因素。

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质粒 DNA 的纯度和质量对于成功转染而言至关重要。使用不含苯酚、氯化钠和内毒素的高纯度质粒 DNA 时，可获得最佳结果。污染物会杀灭细胞，盐会干扰脂质体复合，从而降低转染效率。内毒素又称脂多糖，在质粒制备物的裂解步骤中释放，常与质粒 DNA 共纯化。内毒素的存在可大大降低原代细胞和其他敏感细胞的转染效率。我们建议使用 PureLink HiPure 质粒试剂盒（小提、中提、质粒大提、超大量和宏量）分离质粒 DNA，以提供高质量 DNA 用于转染。

虽然氯化铯梯度离心也能产生高纯度的 DNA，但此过程费力且耗时。过度涡旋 DNA-脂质体复合物或 DNA 溶液可能导致一定程度的剪切作用（尤其是使用较大分子的情况下），从而降低转染效率。稀释的 DNA 中 EDTA 的浓度不应超过 0.3 mM。

启动子的选择具体取决于宿主细胞系、要表达的蛋白和所需的表达水平。许多研究人员选择使用强 CMV（巨细胞病毒）启动子，因为其适用的细胞类型广泛，且可提供较高的表达活性。用于在哺乳动物细胞中进行高水平蛋白表达的另一个强启动子是 EF-1α（人延伸因子-1α）。然而，如果使用过强的启动子驱动可能具有毒性的基因进行表达，则可能导致质粒 DNA 瞬时转染出现问题。对于可能具有毒性的基因产物，建议使用弱启动子。

在筛选稳定转染细胞时，毒性基因产物也是所面临的一个问题。当抗生素抗性基因表达对转染细胞的健康不利时，表达这种基因的细胞将失去生长优势，从而无法获得具有组成型启动子的稳定转染克隆。在这种情况下，可以使用诱导型启动子控制基因表达的时机，从而实现稳定转染子的筛选。诱导型启动子通常需要在存在某种诱导分子（如金属离子、代谢物或激素）的情况下才能发挥功能，不过有些诱导型启动子则以相反方式发挥功能，即需要在没有某种特定分子的条件下才会诱导基因表达。

细胞类型特异性启动子也很常见，如用于昆虫细胞表达的多角体蛋白启动子。文献检索是用于确定哪种启动子最适合您的细胞系或应用的最佳工具。

无论使用何种转染方法，重要的是设置对照转染以检查细胞的健康状况，判断该报告基因检测系统是否正常工作，并确定是否存在任何插入相关问题。为检查是否采用了最佳的细胞生长条件，请纳入阴性对照（无 DNA，无转染试剂）。为确定报告基因检测系统是否正常工作，请纳入阳性对照（采用成熟的转染方法进行平行转染）。为确定是否存在插入相关问题，请使用不含目标基因的质粒进行转染。