影响转染效率的因素

成功转染受许多因素的影响，转染方法的选择、细胞系的健康状况和活力、传代次数、汇合度、所用核酸的质量和数量以及培养基中是否含血清都会对您的转染实验结果产生一定的影响。通过优化特定转染条件能够获得高转染效率，但重要的是要注意，无论使用何种转染方法，都会不可避免地会造成一些细胞死亡。

转染实验在细胞类型方面的选择似乎较为明确，但却是一个经常被忽视的关键因素。每种细胞类型对特定转染试剂或方法可能有不同的反应，因此，只有选择了合适的细胞类型和正确的实验设计，才能将结果最大化。

虽然已建立的传代细胞系更易于实验室操作，但此类细胞系已发生多种基因变化，可能不是体内建模的最佳选择。然而，如果转染实验的目的是生产高水平的重组蛋白，那么只要细胞系能够表达足量且经适当折叠和翻译后修饰的重组蛋白即可，无需在意细胞系是否可体现体内情况。例如，将适应悬浮培养的 Gibco Expi293F 细胞置于 Gibco Expi293 表达培养基中培养并进行瞬时转染，可让研究人员从目标载体开始操作，生产获得大于 1 g/L 的经正确折叠和糖基化的重组蛋白。

另一方面，原代细胞培养物由于与天然组织更加相似，因此也经常用于此类实验。然而，此类细胞的生长潜力和寿命通常有限，培养物也更难维持。在使用原代细胞培养物时，重要的是应维持大量均一的细胞群（例如，神经元培养物应富含神经元，同时抑制神经胶质细胞），并尽快使用细胞。

此外，在设计转染实验时必须考虑细胞类型的生物学特性。例如，一些启动子在不同的细胞类型中功能不同，一些细胞类型不太适合应用某些转染技术。

图6.1 不同细胞系的转染效率差异。 使用 Invitrogen 产品系列（如 Lipofectamine 2000 试剂和 Lipofectamine 3000 试剂）在24孔板中用表达 GFP 的质粒转染17个细胞系（0.5 µg 质粒/孔，每种试剂的使用遵循推荐方案）。转染48小时后分析 GFP 的表达。每个条件重复检测三次，数据点表示为平均转染效率+标准差。

据悉，转染前细胞的活力和总体健康状况是各转染之间产生变异性的重要来源。一般而言，转染前细胞应至少保持 90% 的活力，并在传代后有足够的时间恢复。我们强烈建议在转染前至少24小时进行传代培养，以确保细胞在传代培养程序后能够恢复，并处于转染的最佳生理条件。

永生化细胞系的细胞培养物在实验室中历经数月至数年的进化，导致细胞在转染方面的行为发生变化。过度传代很可能会对转染效率以及整个细胞群的总体转基因表达水平产生不利影响。一般而言，我们建议使用储备培养物解冻后传代少于30次的细胞。新解冻冷冻细胞冻存管后，建立低传代培养物用于转染实验，可确保细胞的转染活性得以恢复。为了获得最佳重现性，可将低传代次数的细胞分装冷冻储存，在需要时解冻。新解冻细胞冻存管后，进行3次或4次传代。

污染会严重影响转染结果，因此应常规进行细胞培养物和培养基的生物污染检测（参见生物污染），切勿使用受到污染的培养物和培养基进行转染。如果细胞受到污染或其健康状况受到任何损害，应将其丢弃，并取未污染的冷冻储备培养物重新接种。

为了获得最佳的转染结果，请遵循常规的传代培养程序，使用恰当的稀释度每周传代一次或两次，以确保细胞在下一次传代前接近汇合。请确保细胞保持汇合的时间不超过24小时。

转染的最佳细胞密度取决于具体的细胞类型、应用和转染技术，应为每个待转染的新细胞系确定相应的最佳密度。采用标准接种方案进行各次实验，以确保转染时细胞均可靠达到最佳汇合度。使用阳离子脂质体介导转染的情况下，转染时贴壁细胞一般达到 70%-90% 的汇合度，悬浮细胞达到 5 × 10⁵ 至 2 × 10⁶ 个细胞/mL 的密度，即可获得良好的结果。

转染时应确保细胞没有汇合或处于静止期，因为与静止细胞相比，活跃分裂的细胞能够更好地摄取外源核酸。细胞密度过高可引起接触抑制，导致核酸摄取不良和/或转染基因表达下降。然而，培养物中细胞过少时，由于缺乏细胞间接触，可能导致生长不良。在这种情况下，增加培养物中的细胞数量可以提高转染效率。同样，病毒载体在活跃分裂的细胞系中转导更有效。当用病毒构建体转导不分裂细胞类型时，可能需要增加 MOI（即感染复数）以达到最佳转导效率并增加重组蛋白的表达水平。

不同的细胞或细胞类型都有非常特定的培养基、血清、补充剂要求，选择最适合细胞类型的培养基和转染方法在转染实验中起着非常重要的作用。有关针对给定细胞类型选择适当培养基和转染方法的信息通常可在已发表的文献中获得，也可从细胞来源处或细胞库中获得。如果没有关于您所用细胞类型的适当培养基的可用信息，您必须根据经验确定。

请务必使用新鲜培养基，当存在任何不稳定组分时尤其如此，因为缺失关键组分和必要补充剂的培养基可能会损害细胞生长。

有关细胞培养基的信息，请参见常见细胞系的培养基建议。一些细胞系和原代细胞可能需要特殊的包被材料（如多聚赖氨酸、胶原蛋白、纤连蛋白等）以附着于培养板并获得最佳的转染结果。

一般而言，培养基中存在血清可增强 DNA 转染。然而，在进行阳离子脂质体介导的转染时，应在没有血清的情况下形成 DNA-脂质体复合物，这一点非常重要，因为一些血清蛋白会干扰复合物的形成。请注意，在有血清的情况下，阳离子脂质体试剂和 DNA 的最佳量可能发生变化；因此，当使用含血清的转染培养基时，应优化转染条件。

当用 RNA 转染细胞时，我们建议在没有血清的情况下执行转染程序，以避免可能的核糖核酸酶污染。大多数细胞在无血清培养基中可保持健康数小时。

血清质量可显著影响细胞生长和转染结果。因此，应注意控制不同品牌甚至不同批次血清之间的变异性，以确保获得最佳结果，这非常重要。检测血清对细胞的影响后，应继续使用相同的血清，以避免结果发生变化。对所有 Gibco™ 产品（包括血清）进行污染检测，保证其质量、安全性、一致性和法规合规性。

一般情况下，用于瞬时转染的培养基中可含抗生素。不过，由于阳离子脂质体试剂可增加细胞通透性，因此也可能增加递送到细胞内的抗生素量，从而导致细胞毒性以及较低的转染效率。因此，我们不建议在转染培养基中加入抗生素。在铺板细胞用于转染时，避免使用抗生素也可减少转染前冲洗细胞的需求。

对于稳定转染，不应在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是 Gibco Geneticin 选择性抗生素的竞争性抑制剂。在构建稳定的细胞系时，在转染程序后预留 48-72 小时供细胞表达抗性基因，之后再加入选择性抗生素。

如果使用无血清培养基，抗生素的用量应低于含血清培养基中的用量以维持细胞健康。

质粒 DNA 是最常用的转染载体。质粒 DNA 载体的拓扑结构（线性或超螺旋）和大小会影响转染的效率。用超螺旋质粒 DNA 进行瞬时转染的效率最高。在稳定转染中，相对于超螺旋 DNA，虽然使用线性 DNA 会导致细胞的 DNA 摄取量较低，但 DNA 整合到宿主基因组中的效果更优。

虽然寡核苷酸、RNA、siRNA 和蛋白质等其他大分子也可以转染到细胞中，但在使用这些大分子时，需要优化质粒 DNA 的作用条件。

有许多策略可将核酸导入细胞，包括各种生物、化学和物理方法。然而，并非任何方法都适用于所有类型的细胞和实验应用，不同的方法在转染效率、细胞毒性、对正常生理的影响、基因表达水平等方面均存在广泛的差异。应根据您的细胞类型和实验需求来选择理想的方法，且方法应具有高转染效率、低细胞毒性、对正常生理的影响尽可能小、易于使用和可重现。有关各种转染方法的概述和比较，请参见基因递送技术。