优化 siRNA转染实验流程

在尽可能提高siRNA转染实验流程效率的同时尽可能减小细胞毒性对于实现最佳的基因沉默至关重要。类似于在 siRNA 诱导的敲低与细胞活力之间实现平衡，siRNA实验中递送和下游表型检测条件之间也可能存在平衡。针对 siRNA 筛选通过实验中使用的不同下游检测，可能有必要重新优化 siRNA转染实验流程的递送条件。通过确定以下因素（按重要性排序），在每种细胞类型中达到最佳转染效率：

1. 转染试剂选择
2. 转染试剂体积
3. siRNA 量
4. 转染时的细胞密度
5. 细胞暴露于转染试剂/siRNA 复合物的时长
6. 转染方法：传统转染（细胞需提前铺板）；或反向转染（在细胞贴壁时进行转染）
7. 是否存在血清
   

确定可实现最佳基因沉默效果的条件后，应在特定细胞类型的实验中保持条件恒定。

1. 为每个基因设计并检测 2-4 个 siRNA 序列请勿尝试自己设计 siRNA。单击此处，利用领先的设计算法设计您的 siRNA。
   
   
2. 谨防核糖核酸酶！微量核糖核酸酶即可毁掉 siRNA 实验。由于核糖核酸酶存在于整个实验室环境中，包括您的皮肤、空气中、徒手接触的任何地方或暴露在空气中的任何物体上，因此，采取措施防止和消除核糖核酸酶污染非常重要。Life Technologies™ 提供了可用于检测和消除核糖核酸酶的完整产品系列。
   
   
3. 维持细胞培养物健康并遵循严格的操作方案，以获得良好的转染可重现性。一般而言，健康细胞的转染效率高于健康状况不佳的细胞。通常用传代次数较低的细胞进行传代培养，以尽量降低试验之间所用连续细胞系的不稳定性。在进行优化实验时，由于转染效率会随着时间的推移而下降，因此我们建议在50代内转染细胞。
   
   
4. 避免使用抗生素。在铺板期间和转染后72小时内应避免使用抗生素。已证明抗生素可在透化的细胞中蓄积达到毒性水平。此外，一些细胞和转染试剂需要在无血清的条件下实现最佳的 siRNA 递送。我们建议您在正常生长培养基和无血清培养基中分别进行转染预试验，以确定每次转染的最佳条件。
   
   
5. 使用优化的试剂转染 siRNA。根据您的细胞类型使用优化的 siRNA 转染试剂和操作方案。转染试剂的选择对于 siRNA 实验的成功至关重要。使用专为递送小 RNA 配制的转染试剂至关重要（大多数市售转染试剂是设计用于大质粒 DNA，而不是小 RNA 分子）。此外，有些试剂为特定细胞系专用的转染试剂，但也有特异性更广的试剂。有关适当转染试剂的选择，请参见 siRNA 转染。
   
   
6. 使用适当的阳性对照来优化转染和检测条件。管家基因适合用作大多数细胞类型的阳性对照。在优化条件时，对于您选择的阳性对照的特异性 siRNA 和您的实验靶标 siRNA，用多种浓度转染靶细胞。转染48小时后，测量对照蛋白或 mRNA 水平较未转染的细胞的降低情况。过多的 siRNA 会导致细胞毒性和死亡。为方便您使用，Life Technologies™ 提供了针对多种基因靶标的阳性对照 siRNA。
   
   
7. 使用阴性对照 siRNA 区分非特异性效应。应通过扰乱最活跃 siRNA 的核苷酸序列来设计阴性对照。但是，请务必进行同源性搜索，以确保您的阴性对照序列与所研究深恶体的基因组缺乏同源性。
   
   
8. 使用标记的 siRNA 进行方案优化。荧光标记的 siRNA 可用于分析 siRNA 稳定性和转染效率。标记的 siRNA 也有助于研究 siRNA 亚细胞定位，在双重标记实验（涉及标记的抗体）中使转染过程中接受 siRNA 的细胞显像，并将转染与靶蛋白的下调相关联。