选择 RNAi 策略

两种常用的 RNAi 递送方法是脂质体介导的转染和病毒介导的转导。使用方法的选择取决于所研究的细胞类型以及需要瞬时敲低还是稳定敲低。最普遍的应用是 Silencer Select siRNA 和 Stealth RNAi siRNA 双链瞬时转染，其使用阳离子脂质体试剂，因为这类试剂适用于在各种常用细胞系中进行分子递送（参见非载体 siRNA 技术）。

对于不适合脂质体介导转染的细胞类型，通常使用病毒载体进行转染（参见载体介导的 RNAi）。腺病毒载体适用于多种细胞类型的瞬时递送。然而，当需要稳定表达 RNAi 时或者对于难以转染的细胞系（例如不分裂细胞），慢病毒载体是最佳的递送方法。确定最有利 RNAi 递送条件的另一种方法是使用 Life Technologies 递送优化服务，这是在病毒载体和非病毒递送试剂方面具有大量知识储备的专业科学资源，可用于测试递送参数矩阵。

siRNA 和基于载体的 RNAi 都可以高效地产生功能丧失表型。一般而言，大多数研究人员选择 siRNA 是因为可以快速启动实验，除了基本的细胞培养技术外，不需要特殊的准备。然而，促使研究人员选择 siRNA 还是选择基于载体的 RNAi 的原因有很多。

研究人员通常希望能够获得尽可能高的转染效率。这一目的对于 RNAi 应用尤为重要，因为未转染细胞将继续表达要敲低的靶向基因，从而导致具有背景表达水平。

对于许多疾病模型，最理想的细胞类型是原代细胞培养物。然而，这些细胞不能用市售的阳离子脂质体介导转染试剂充分转染。有效的替代方法是用病毒递送表达 RNAi 序列的载体。该方法适用于递送至难以转染的原代细胞和不分裂细胞中。病毒递送也可用于构建能够进行诱导型 RNAi 表达的稳定细胞系或在组织特异性启动子的控制下表达 RNAi 序列。

对于瞬时敲低实验，采用合成的非载体方法进行 RNAi 递送与基于载体的方法相比优势更加显著。具体而言，非载体实验通常更容易设计和执行，并可获得更高水平的瞬时敲低。此外，最近 RNAi 设计有所改进，使得只测试少量 RNAi 分子后即可实现高水平敲低的可能性增加。因此，使用以合成方式生成的 RNA 双链是更普遍的 RNAi 实验方法。

哺乳动物细胞中基因敲低的传统 RNAi 方法涉及使用合成 RNA 双链，其由两条未经修饰的 21-mer 寡核苷酸组成，经退火形成短/小干扰 RNA (siRNA)。Life Technologies 的 Silencer Select siRNA 和 Stealth RNAi siRNA 通过利用专有化学修饰技术，在这些传统双链基础上有所改进，以确保获得更好的 RNAi 结果。了解更多关于 siRNA 分析的信息

• Silencer siRNA 是 Ambion 设计的 siRNA，可用于 RefSeq 数据库中的所有人类、小鼠和大鼠基因靶标。这些 siRNA 是利用高效且经广泛测试的算法设计得到，专门用于实现极高效力和特异性的基因沉默。每种 siRNA 均按照最高质量标准进行合成并且提供完整的序列信息。
• Stealth RNAi siRNA 分子是经过化学修饰的平末端 25-mer 双链结构，可被 RNA 诱导沉默复合体 (RISC) 识别，介导对靶基因的抑制。专有的化学修饰技术使得 Stealth RNAi siRNA 能够克服许多体内特异性障碍，确保在体内应用中的有效性和稳定性。
• Silencer Select siRNA 是体外研究中性能优异的 siRNA，具有包括预铺板集合和定制文库在内的多种规格可供选择，用于简化筛选实验。其效力高达其他 siRNA（修饰和未修饰）的100倍，可提高“中靶”表型的百分比。

使用与蛋白编码基因相似的策略进行 miRNA 功能分析。用 miRNA 模拟物转染培养的细胞有助于鉴别功能获得表型；使用 miRNA 抑制剂进行下调或抑制实验可以鉴别功能丧失表型。上调与下调相结合可用于鉴别受特定 miRNA 调控的基因和细胞过程。了解更多关于 miRNA 分析的信息。

• Ambion Pre-miR miRNA 前体分子是经过化学修饰的双链 RNA 小分子，与 siRNA 相似但不完全相同，设计用于模拟内源性成熟 miRNA。
• mirVana miRNA 模拟物是经过化学修饰的双链 RNA 小分子，模拟内源性 miRNA，通过上调 miRNA 活性实现 miRNA 功能分析。由于通过专有化学修饰技术使星体链失活，这些分子的特异性较前身更高。mirVana miRNA 模拟物可单独使用或作为文库使用
• Ambion Anti-miR miRNA 抑制剂是经过化学修饰的单链核酸，设计用于特异性结合并抑制内源性 miRNA。
• mirVana miRNA 抑制剂是经过化学修饰的单链 RNA 小分子，设计用于特异性结合并抑制内源性 miRNA 分子，并可通过下调 miRNA 活性进行 miRNA 功能分析。在现有 miRNA 模拟物的最低 miRNA 抑制剂浓度条件下，其具有较高的体外抑制效价。mirVana miRNA 抑制剂可单独使用或作为文库使用。

这些合成分子由于体积较小，比载体更容易转染，并且可以使用与 siRNA 相同的条件进行递送。与 miRNA 表达载体相比，这些分子也可用于量效研究。

使用 siRNA 转染试剂可轻易将 siRNA 导入细胞。在插入哺乳动物细胞中后不久，siRNA 分子成为 RNA 诱导沉默复合体 (RISC) 的一部分。在 siRNA 反义链的引导下，RISC 降解靶向的 mRNA，抑制其翻译。然后，进行试验以检测 RNAi 活性。一般而言需要设置对照，以便可以正确比较 RNAi 结果。

RNAi 的成功依赖于在预期可产生最大反应时正确递送适量 siRNA。此精度的把握可能很难。siRNA 脱靶会造成严重后果，有时会导致分析问题。研究人员正在寻找设计和递送 siRNA 的更好方法。

对于不适合脂质体介导转染的细胞类型，如难以转染的细胞、原代细胞和不分裂细胞，通常使用含有 RNAi 基因盒的病毒载体。病毒递送也可用于构建能够进行诱导型 RNAi 表达的稳定细胞系或在组织特异性启动子的控制下表达 RNAi 序列。腺病毒载体适用于多种细胞类型的瞬时递送，而慢病毒载体在分裂细胞和不分裂细胞中均具有稳定递送效果，慢病毒载体是最优的选择。了解更多关于载体介导的 RNAi 的信息

• BLOCK-iT 腺病毒 RNAi 表达系统可促成复制缺陷型腺病毒的构建和递送，在大多数分裂或不分裂的哺乳动物细胞类型和动物模型中瞬时表达 shRNA，进而用于 RNAi 分析。BLOCK-iT 腺病毒 RNAi 表达系统的关键优势在于 Gateway® 重组技术，该技术简化了腺病毒载体的克隆和生成，省去了其他腺病毒系统所需繁琐耗时的操作、筛选和多重转化。
• BLOCK-iT 慢病毒 RNAi 表达系统能够构建工程化 shRNA 和 miRNA 并递送到分裂和不分裂的哺乳动物细胞中，包括原代细胞和难以转染的细胞。该系统可以在不进行选择的情况下用于瞬时 RNAi 分析，也可以在采用适当抗生素进行选择的情况下，生成用于长期敲低研究的稳定细胞系。
• BLOCK-iT 慢病毒 Pol II miR RNAi 表达系统结合了 BLOCK-iT Pol II miR RNAi 和 ViraPower 慢病毒技术，便于构建工程化 miRNA 并稳定地递送到不分裂细胞、原代细胞和难以转染的细胞中。表达载体中的 Pol II 启动子能够实现多个 miRNA 的顺反子共表达，允许敲低源自单个构建体的多个靶标，该过程适合敲低一个以上通路组分或剪切变异体或者用于通过敲低操作构建合成表型。
• 含 EmGFP 的 BLOCK-iT 慢病毒 Pol II miR RNAi 表达系统具有上述 BLOCK-iT 慢病毒 Pol II miR RNAi 表达系统的所有组分和优点，另外还可利用 EmGFP 顺反子共表达轻松实现表达追踪。HiPerform 版本的表达载体含有 mRNA 稳定序列 (WPRE) 和核导入序列 (cPPT)，可产生高达5倍的病毒滴度。
• BLOCK-iT 诱导型 H1 慢病毒 RNAi 系统是一个完整的慢病毒系统，可在任何细胞类型中实现长期诱导型或组成型 shRNA 表达。通过四环素操纵子 (TetO₂) 序列对 RNAi 反应进行调节，可研究经时变化和进行功能丧失实验（即使是必需基因），并提供极佳的控制系统用于测量基因功能恢复过程中的表型变化。