Mandavilli BS, Neeley C, Bates M, Persmark M (2015) BioProcessing Journal 14:44–49.

（参见本文中的特色产品列表。）

从发育研究到癌症生物学研究，不断扩大的 3D 细胞培养应用促进了新试剂和技术的开发，进而支持这些不同的研究领域。球体（或球状体培养）是 3D 体外培养的重要部分，它可模拟体内正常和恶性组织的多个特征，包括细胞间相互作用、营养梯度和扩散动力学以及基因表达谱 [1,2]。Mandavilli 和同事在 BioProcessing Journal 上发表了一篇文章，概述了球体培养的历史、挑战和潜力。下面是其文章的简要总结。

细胞外基质

细胞外基质 (ECM) 通常由可溶性蛋白和不溶性胶原纤维组成，不仅为复杂组织提供了支架，而且在信号传导、细胞分化和体内稳态方面也起着重要作用。培养球体时，ECM 黏附性蛋白质通过与培养容器表面相互作用来干扰球体形成，从而导致卫星集落的形成。图1显示了未经处理微孔板和 Thermo Scientific Nunclon Sphera 微孔板上球体形成的时间进程，后者包被了最近开发的亲水性聚合物，可促进球体的生长而不会产生卫星集落。

除了培养容器的开发外，我们还提供多种类型的工程化 ECM，适合在 3D 培养系统中使用。有关在类组织基质中生长的 3D 培养物的讨论，请参阅第11页上的“第三维度的癌症生物学”。

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图1.使用 Nunclon Sphera 微孔板与含甲基纤维素的未经处理微孔板形成癌症球体的比较。将维持在 Thermo Scientific Nunclon Delta 细胞培养瓶中的 HCT 116 细胞以 100–3,000 个细胞/孔的密度接种到 Thermo Scientific Nunclon Sphera 96孔 U 形底微孔板上的 200 μL/孔 Gibco DMEM（含高糖、GlutaMAX 添加剂和丙酮酸盐）中，该培养基含有 10% FBS、1X MEM 非必需氨基酸、100 U/mL 青霉素–链霉素和 25 mM HEPES。对于未经处理即用于细胞或组织培养的传统微孔板（未经处理微孔板），以类似方式接种到同样含 3% 甲基纤维素的完全 DMEM 培养基中。将微孔板以 250 x g 的设置短暂离心5分钟，然后在 37°C 和 5% CO2 条件下孵育；通过小心地从每孔中取出 100 μL 培养基然后补充 100 μL 新鲜培养基的方式，重新喂养细胞，每72小时一次。对球体的形成和生长进行成像。(A) 孵育112小时后，在所有接种密度下与在未经处理微孔板上生长的癌细胞球体相比，在 Nunclon Sphera 微孔板上生长的癌细胞球体均表现为形状更均匀、边缘更清晰且背景更纯净。(B) 接种密度为100个细胞/孔时，Nunclon Sphera 微孔板上球体形成的早期时间进程在18小时后即显示出球体，并且卫星集落数量远少于未经处理微孔板中的数量。图像经 Helmut Dolznig (Institute of Medical Genetics, Medical University of Vienna) 许可使用。

氧气在细胞培养中的作用

与 2D 细胞培养一样，培养球体需要精确控制非生物条件，包括温度、pH 值、氧气和二氧化碳水平，此外还要拥有包被培养容器等专用设备。20多年前，研究人员发现，与大气中的氧气条件 (20%) 相比，在更接近人体内氧气条件（1%–12%）的受控氧气条件下，胚胎组织培养和成纤维细胞组织培养都更加成功。在这些低氧条件下培养的细胞增长速度更快、寿命更长且表现出更低的应激水平 [3-5]。采用可控制氮气、二氧化碳和氧气的细胞培养箱是实现低氧条件的较佳方法。带有台式培养箱的 Invitrogen EVOS FL 自动成像系统具有一个环境箱，可在较长一段时间内以及在活细胞成像期间精确控制含氧量、温度和湿度。

孵育和成像过程中的含氧量控制功能，与细胞内含氧量实时荧光指示器的开发相结合，共同促进了 2D 和 3D 细胞培养方法的发展。Invitrogen Image-iT 缺氧监测试剂是一种细胞渗透性探针，当含氧量低于 5% 时开始发出荧光，实现对细胞缺氧情况进行灵敏、可重现的测量（图2）。与 2D 培养中生长的细胞不同，球体具有非均相细胞成分，位于表面的细胞与隐藏在中间的细胞功能不同。特别是球体具有与肿瘤相同的缺氧核心，细胞快速增长超过了血液供应，使得肿瘤中心的氧浓度极低。这些长期缺氧区域对治疗具有高度耐受性，因为化疗尤其难以渗透这些区域。Image-iT 缺氧监测试剂已用于表征球体中的缺氧核心（图3）。

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图2.3D 培养中生长的细胞的缺氧检测。在不同含氧量下 — (A) 20%、(B) 5%、(C) 2.5% 和 (D) 1%，在包含 5 μM Invitrogen Image-iT 缺氧监测试剂的 Gibco FluoroBrite DMEM 中孵育 A549 细胞，在 Invitrogen EVOS 台式培养箱中孵育1小时，然后使用 Invitrogen EVOS FL 自动成像系统进行成像。当含氧量低于 5% 时，可以检测到红色荧光缺氧信号。

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图3.单个 HeLa 细胞球体中的缺氧核心评估。在 Thermo Scientific Nunclon Sphera 96孔 U 形底微孔板上用完全培养基培养 HeLa 细胞（250个细胞/孔）2天。然后使用 5 μM Invitrogen Image-iT 缺氧监测试剂（红色）将球体原位孵育3小时，并使用 Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes 试剂（蓝色）对细胞核进行复染。用广口移液器吸头将染色后的球体转移到 Thermo Scientific Nunc 玻底培养皿 (12 mm) 上，并使用共聚焦显微镜拍摄图像。

癌症生物学研究用球体

除了缺氧核心，已有报告称球体还可以复制肿瘤的其他关键元素，包括坏死、血管生成和细胞黏附。因此，球体培养不仅对于研究细胞、组织和 ECM 之间的相互作用如何影响病理状态具有重要意义，而且对于开发更强大的药物筛选计划和改进的器官型模型同样具有重要意义。

参考文献

  1. Fennema E, Rivron N, Rouwkema J, et al.(2013) Trends Biotechnol 31:108–115.
  2. Hirschhaeuser F, Menne H, Dittfeld C et al.(2010) J Biotechnol 148:3–15.
  3. Parrinello S, Samper E, Krtolica A et al.(2003) Nat Cell Biol 5:741–747.
  4. Atkuri KR, Herzenberg LA, Niemi AK et al.(2007) Proc Natl Acad Sci USA
  5. Lengner CJ, Gimelbrant AA, Erwin JA et al.(2010) Cell 141:872–883.

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