优化球状体培养的微孔板检测方案

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3D 细胞模型现在越来越多地用于癌症、免疫肿瘤学、神经科学等研究领域，因为其微环境更接近体内系统（组织组织、器官和肿瘤）的微解剖结构，其中包含复杂而动态的细胞类型、化学梯度和细胞外基质 (ECM) 组分。使用最初开发用于单层 (2D) 细胞培养的细胞健康检测法和方案时，3D 细胞结构的复杂性会带来挑战。这里我们重点介绍了调整和优化适用于球状体培养的基于微孔板的 2D 细胞培养活力检测法的几个基本考虑因素，重点是优化试剂浓度和孵育时间。

球状体培养的最佳试剂浓度将提供高检测特异性信号，并极大程度地降低非特异性背景，从而产生高信噪比 (S/N)。高 S/N 比的检测法在检测细胞处理（如暴露于药物或试验化合物）引起的细胞健康变化方面具有较高的灵敏度。为了证明该效应，我们使用 Invitrogen CyQUANT XTT 细胞活力检测试剂盒检测了从人肺上皮细胞（A549 细胞）获得的球状体，该比色微孔板检测法最初开发用于评估 2D 细胞活力与氧化还原电位的关系（图1）。我们在不存在或存在递增浓度的细胞毒性药物藤黄酸的条件下，比较了推荐试剂浓度 (1X) 和 2X 浓度，发现试剂浓度加倍会增加信噪比，进而提高检测灵敏度。我们建议测试多种试剂浓度，以找到适合您的 3D 检测的试剂浓度。

通过进行时间-过程实验和绘制检测信号与孵育时间的关系图，可以确定球状体培养的最佳试剂孵育时间。图2显示了这种时间-过程实验的示例，该实验使用已建立的微孔板活力检测法，通过测量刃天青还原为高荧光（并强烈显色）试卤灵来确定氧化还原电位。使用 Invitrogen PrestoBlue HS 细胞活力试剂和多个孵育时间，我们比较了 A549 细胞在 2D 单层生成的荧光与 A549 细胞衍生的球状体的荧光。检测方案建议 2D 细胞培养的孵育时间为10分钟至3小时，在时间-过程曲线的线性范围内。基于我们的球状体实验，我们建议将孵育时间延长至5至10小时，以极大程度地增加信号并保持在该曲线的线性范围内。