Click-iT EdU 流式细胞增殖试剂盒

检测细胞增殖能力是评估细胞健康状况和基因毒性以及评价抗癌药物的基本方法。最准确的方法是直接检测 DNA 的合成。最初，通过掺入的放射性核苷（即 3H-脱氧胸腺嘧啶核苷）可以检测DNA合成。随后基于抗体的溴脱氧尿苷（BrdU，核苷类似物）检测法取代了这种检测方法。Click-iT EdU 流式细胞检测试剂盒是替代 BrdU 检测的新方法。EdU（5-乙炔-2´-脱氧尿苷）是脱氧胸腺嘧啶核苷类似物，在DNA合成活跃期掺入 DNA 中。检测基于 click 反应(1-4)，这是铜催化的叠氮化物和炔烃之间的共价反应。在这个反应中，EdU 的乙炔基团提供炔烃，Pacific Blue™ 染料、Alexa Fluor 647 染料或 Alexa Fluor 488 染料提供叠氮化物。标准的流式细胞方法用于确定 S 期细胞比例（图 1）。

Click-iT EdU 标记的优势在于小分子的叠氮化物染料在温和条件下可有效检测掺入的 EdU。标准的甲醇固定和洗涤剂破膜足以使 Click-iT 检测试剂进入核内与DNA结合。这与 BrdU 检测相反，BrdU 检测需要使DNA 变性（使用酸、加热或用 DNase 消化）， BrdU 才能暴露以便用抗 BrdU 抗体检测。这样的处理会影响细胞周期，且酸变性方法会破坏抗原识别位点。相比之下，EdU 细胞增殖试剂盒能与细胞周期染料兼容（图 2）。EdU 检测也可与表面抗体、胞内抗体共同使用。但是，一些试剂或抗体偶联物与 Click-iT EdU 反应不兼容，可能需要进一步的试验确认（见表 1）。

图 2. Click-iT EdU Alexa Fluor 488 和 FxCycle™ Violet 双参数图。使用 10 μM EdU 处理 Jurkat 细胞（人外周白血病 T 细胞）处理 2 小时，并按照推荐的染色方案进行检测。使用 Attune 声波聚焦流式细胞仪收集和分析数据，选择 488 nm 激光和 530/30 带通来检测 EdU Alexa Fluor 488 叠氮化物，以及选择 405 nm 激光和 450/40 带通来检测 FxCycle™ Violet 荧光。该图将DNA含量与EdU结合在一起；两种标记均为阳性的细胞处于细胞周期的 S 期。

表 1.Click-iT EdU 检测试剂兼容性

试剂盒中的试剂

需要但未提供的材料

• 含 1% 牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲水（PBS），pH 7.1–pH 7.4
• 缓冲盐溶液，如 PBS、D-PBS 或 TBS
• 去离子水或 18 MΩ 纯净水
• 12 × 75-mm 管，或其他流式管

注意事项

• DMSO(组分C)，在本试剂盒中作为溶剂提供，有助于有机分子进入组织。使用正确的操作方法处理含 DMSO 的试剂，避免这类物质产生危害。 应根据所有有关当地法规对试剂进行处理。
• Click-iT 定色剂（组分 D）含有有害的多聚甲醛。使用后应采取适当的预防措施。
• Click-iT 皂素渗透洗涤剂（组分 E）含有叠氮化钠，在酸性条件下会产生剧毒叠氮酸。丢弃前，应用水稀释叠氮化合物，避免在管道中积聚潜在爆炸的沉积物。

方案总结

准备试剂

1.1 让小瓶平衡至室温，然后打开。

1.2 制备 10 mM EdU 溶液：向组分 A 中加入 4 mL DMSO（组分 C）或水溶液（PBS），并充分混合。使用后，剩余液体储存于≤–20°C 。依说明保存，可储存一年。

1.3 制备 Pacific Blue™ 叠氮化物（货号：C10418）、Alexa Fluor 647 叠氮化物（货号：C10424）或 Alexa Fluor 488 叠氮化物（货号：C10425）工作液：向组分 B 中加入 130 μL DMSO，并充分混合。使用后，剩余液体储存于≤–20°C 。依说明保存，可储存一年。

1.4 制备 500 mL 1X Click-iT 皂素渗透洗涤剂：向 450 mL 含 1% BSA 的 PBS 中加入 50 mL 的组分 E。可用 1% BSA 的 PBS，按 1:10 的比例稀释一定体积的组分 E，制备少量溶液。 使用后，剩余液体储存于≤–20°C 。依说明保存，可储存一年。注意：组分 E 含有叠氮化钠（见注意事项）。

1.5 制备 Click-iT EdU 缓冲添加剂（组分 G）的 10X 储备液：向小瓶中加入 2 mL 去离子水，并充分混合，直到 组分完全溶解。使用后，剩余液体储存于≤–20°C 。依说明保存，可储存一年。

使用 EdU 标记细胞

以下方案是针对Jurkat细胞， Jurkat 细胞（一种人 T 细胞系）以及使用浓度为10μM的EdU开发的，可以适用于任何细胞类型生长培养基、细胞密度、细胞类型变化以及其他因素均可能影响标记。在初步实验中，我们建议测试一系列 EdU 浓度，以确定适用于细胞类型和实验条件的最佳浓度。如果目前已经使用 BrdU 检测进行细胞增殖检测，则 EdU 最适起始浓度与 BrdU 类似。如果样本是全血，我们建议采用肝素抗凝管。

2.1 用适当的组织培养基重悬细胞，以获得最佳细胞生长条件。在 EdU 培养前改变培养温度或冲洗来干扰细胞使其减缓生长，使EdU更容易掺入过程。

2.2 向培养基中加入 适量的EdU，并充分混合。我们建议使用EdU的起始浓度为 10 μM ，并培养 1–2 小时。如果培养时间更长，要使用更低的浓度。如果培养时间较短，可能需要使用更高的浓度。要设置阴性染色对照，即未使用 EdU 处理的同一来源的细胞。

2.3 在最适合的条件下孵育适当的时间通过改变细胞暴露于 EdU 的时间，或对使用 EdU对细胞进行脉冲标记，可评价 DNA 合成和增殖参数。 脉冲标记的有效时间间隔和每个脉冲的长度取决于细胞生长率。

2.4 收集细胞，如果进行抗体表面染色，则立即执行步骤 3.1；否则继续步骤 4.1。

用抗体进行细胞表面染色（可选）

3.1 使用 3 mL 含 1% BSA 的 PBS 洗涤细胞一次，离心，去上清。

3.2 用 1% BSA 的 PBS 重悬细胞，使细胞浓度达 1 × 107 个细胞/mL。

3.3 向流式管中加入 100 μL 的细胞悬液或全血样本。

3.4 加入表面抗体，并充分混合（第 3 页，表 2）。注意：在进行 click 反应前，请勿使用 PE、PE 串联化合物或 Qdot 抗体偶联物；静止直到步骤 6.1，使用这些荧光染料进行标记。

3.5 在建议的时间和温度下避光孵育。3.6 执行步骤 4.1，进行细胞固定。

固定和破膜

Click-iT 皂素渗透洗涤剂可用于含有红细胞的全血或细胞悬液以及含有一种以上细胞类型的细胞悬液。在溶解红细胞时，该渗透洗涤剂可保持白细胞的光散射特性。

4.1 使用 3 mL 含 1% BSA 的 PBS 洗涤细胞一次，离心，去上清。

4.2 加入 100 μL 的 Click-iT 定色剂（组分 D），并充分混合。

4.3 在室温下避光孵育细胞 15 分钟。

4.4 使用 3 mL 含 1% BSA 的 PBS 洗涤细胞，离心，去上清。如果样本中有红细胞或血红蛋白，则重复洗涤。去除所有残留红细胞碎片和血红蛋白，然后继续操作。

4.5 用100 μL 的 1X Click-iT 皂素渗透洗涤剂（在步骤 1.4 中制备）重悬细胞，并充分混合。孵育细胞 15 分钟，或直接执行步骤 5.1，进行 click 标记。

Click-iT 反应

5.1 用去离子水中按 1:10 的比例稀释 10X 储备液（在步骤 1.5 中制备），制备 1X Click-iT EdU 缓冲添加剂。

5.2 根据表 2，制备 Click-iT 反应混合物。

注意： 制备好Click-iT 反应混合物要在15分钟内反应。

表 2.Click-iT EdU 反应混合物

5.3 向没管中加入 0.5 mL 的 Click-iT 反应混合物，并充分混合。

5.4 在室温下避光培育反应混合物 30 分钟。

5.5 使用 3 mL 的 1X Click-iT 皂素渗透洗涤剂（在步骤 1.4 中制备）洗涤细胞一次，离心，去上清。如果进行步骤 6.1 中的细胞内抗体染色，则用 100 μL 的 1X Click-iT 皂素渗透洗涤剂重悬细胞中。否则，加入 500 μL 的 1X Click-iT 皂素渗透洗涤剂，并执行步骤 7.1，对 DNA 进行染色，或执行步骤 8.1，在流式细胞仪上分析。

细胞膜或细胞内靶标染色（可选）

6.1 使用流式染料标记的细胞膜抗体或细胞内抗体。充分混匀。

6.2 在避光及合适的温度时间下孵育抗体。

6.3 使用 3 mL 的 1X Click-iT 皂素渗透洗涤剂（在步骤 1.4 中制备）洗涤细胞，离心，去上清。清除细胞沉淀，使用 500 μL 的 1X Click-iT 皂素渗透洗涤剂重悬细胞，并执行步骤 7.1，对 DNA 进行染色，或执行步骤 8.1，在流式细胞仪上分析。

对细胞DNA染色 （可选）

7.1 必要时，向每管中加入核糖核酸酶 A 并混合（表 3）。

表 3.Click-iT EdU 与 DNA 含量染色剂的兼容性

7.2 向每管中加入适当的 DNA 染色剂，充分混合，并依照说明进行孵育。

采用流式细胞术进行分析

如果在采用流体动力学聚焦的传统流式细胞仪测定总 DNA 含量，则使用较低流速进行收集。使用 Attune 声波聚焦流式细胞仪时，对于低于每秒 10000 的事件，所有的收集速率都适用，并且能保证信号完整无损失。但是，同一次实验中的素有样本，都应使用相同的收集速率和细胞浓度。最好通过线性放大来检测 DNA 含量染色剂所产生的荧光信号。最好通过对数放大来检测 Click-iT EdU 标记所产生的荧光信号。

8.1 使用流式细胞仪分析细胞。

• 在使用 Pacific Blue™ 叠氮化物检测 EdU 时，使用紫光带通（450/50 nm或类似波长）和405 nm激发光。
• 在使用 Alexa Fluor 647 叠氮化物检测 EdU 时，使用红光带通（660/20 nm 或类似波长）和633/635 nm激发光。
• 在使用 Alexa Fluor 488 叠氮化物检测 EdU 时，使用绿光带通（530/30 nm 或类似波长）和530/30 nm 激发光。

1. Chembiochem 4, 1147 (2003)
2. J Am Chem Soc 125, 3192 (2003)
3. Angew Chem Int Ed Engl 41, 2596 (2002)
4. Angew Chem Int Ed Engl 40, 2004 (2001)
5. BioTechniques 44, 927 (2008)
6. Curr Protoc Cytom 55, 7.38.1 (2011).