人角质形成细胞的分离、原代培养和冻存

目的

下文介绍了从包皮组织中分离和建立人角质形成细胞原代培养物的推荐程序。还包括传代培养和冻存程序。

介绍

来自皮肤（真皮）的原代人成纤维细胞有助于进行许多科学研究（包括生长因子作用研究、伤口愈合研究、毒性/刺激性研究），并可作为靶细胞用于衍生诱导性多能干细胞。我们提供完整的产品系列，适用于这些细胞在成分明确的非动物源性条件或成分明确的含动物组分条件下的分离、生长和冻存。以下实验方案介绍了从新生儿组织（大约 2 cm²）中分离细胞的方法。如果需要从成人皮肤中分离角质形成细胞，请根据需要处理的组织量适当地调整实验方案。新生儿或成人组织的表皮细胞得率类似（1–3 × 10⁶ 个细胞 /cm²）。

• EpiLife（货号 M-EPI-500-CA）
• 成分明确的非动物源性 (AOF) S7 添加剂（货号 S-017-5）
• EpiLife 成分确定的生长添加剂（EDGS；成分明确的含动物组分添加剂）（货号 S-012-5）
• 分散酶溶液（分散酶溶于 PBS 中，pH 值7.4，不含 Ca/Mg，最终浓度 25 U/mL）（货号 17105-041 和 10010-023）
• 抗生素-抗真菌剂 100X 液体（AA；货号 15240-062）
• 台盼蓝溶液（货号 15260-061）
• 重组胰蛋白酶/EDTA（rTE；货号 R-009-50）
• 成分明确的胰蛋白酶抑制剂（DTI；货号 R-007-100）
• 包被基质试剂盒（货号 R-011-K）
• Synth-a-Freeze（SAF；货号 R-005-50）
• 无菌镊子、剪刀和解剖刀
• 吸收性衬垫
• 15 mL 和 50 mL 无菌锥形离心管
• 100 mm 和 T-75 无菌塑料培养皿和培养瓶
• 单独包装的无菌移液器
• 无菌巴斯德吸管

准备组织

1. 要制备成分明确的非动物原性补充培养基，请在一瓶 500 mL 的 EpiLife 培养基中加入以下物质：

• S7 添加剂 - 5 mL
• 抗生素-抗真菌剂 100X，液体 100X (AA) - 5 mL

要制备成分明确的（含动物制剂）补充培养基，请在一瓶 500 mL 的 EpiLife 培养基中加入以下物质： 

• EpiLife 成分确定的生长添加剂 (EDGS) - 5 mL
• 抗生素-抗真菌剂 100X，液体 100X (AA) - 5 mL

2. 将吸收性衬垫放入层流罩中。
3. 向 100 mm 无菌培养皿中加入约 10 mL 在步骤1中制备的补充培养基。
4. 获取组织并将包含组织的容器放入层流罩中。通过抽吸来处置收集容器上附带的任何培养基。
5. 取下 100 mm 培养皿的盖子，并将其倒置放入层流罩中，以在下面的步骤8中使用。
6. 使用无菌镊子将组织转移到步骤3中制备的培养皿中。
7. 通过使用镊子搅拌 100 mm 培养皿中的培养基来洗涤组织。
8. 使用无菌镊子，将组织铺展平放于 100 mm 培养皿的翻转盖上，表皮侧朝下。如果组织处于管状结构中，请使用小号无菌剪刀切开组织并将其铺展平放在盖子上。
9. 使用剪刀和镊子剪掉所有脂肪和松弛的筋膜。为防止组织变干，请每隔几分钟放入 100 mm 培养皿内的培养基中冲洗一次。
10. 修剪完成后，使用无菌解剖刀将组织切割成大约 0.5 cm × 1.5 cm 的组织条。

分散酶酶解

1. 向 15 mL 无菌锥形离心管中加入 5 mL 分散酶溶液。
2. 将切割的组织转移到含有 5 mL 分散酶溶液的试管中。确保组织块浸没在溶液中。盖紧试管。
3. 取下外层手套，用杀结核菌溶液擦拭试管外侧。适当标记试管。
4. 将试管转移到 4°C 冷藏冰箱中。
5. 在 4°C 下孵育 16–21 小时。

表皮细胞分离和铺板

1. 分散酶酶解后，取回含有组织的试管，并将试管放入层流罩中。
2. 取出一个 100 mm 无菌培养皿，然后取下盖子并将盖子倒置放入层流罩中。
3. 将酶解的组织和附带的分散酶溶液转移到 100 mm 培养皿底部，避免飞溅。如有任何组织块留在瓶中，请使用 1 mL 无菌移液器或无菌镊子将组织块转移到 100 mm 培养皿底部。
4. 将表皮与真皮分开。

• 一次处理几块组织，将组织块移动到培养皿的翻转盖上。调整组织条的方向，使表皮朝上。
• 用一把无菌镊子固定组织条的真皮，用另一把无菌镊子固定表皮边缘。撕开/剥离真皮与表皮，使其分开位于同一盖子上。快速操作，为每个组织块重复该过程。

5. 将 5 mL rTE 溶液添加到 15 mL 无菌锥形管中。
6. 分离所有组织块后，将表皮组织块放入包含 5 mL rTE 溶液的试管中。盖紧试管，并用杀结核菌溶液擦拭试管外部。适当标记试管。要分离和培养真皮成纤维细胞，请参阅人新生儿成纤维细胞的分离、原代培养和冻存实验方案。
7. 在 37°C 水浴中孵育含表皮块的 rTE 溶液30分钟。
8. 孵育期间每5分钟轻轻搅拌试管一次。
9. 30分钟孵育结束后从水浴中取出试管，弄干试管外部，用力搅拌。将试管重新转移到细胞培养层流罩中。
10. 使用 10 mL 移液器将 5 mL DTI 加入细胞悬液中以中和 rTE，然后使用同一移液器上下吸移悬液至少6次以释放表皮细胞。
11. 取下 50 mL 锥形管的盖子（保持盖子无菌），并将一个 70 μm 细胞滤网（货号352350，来自 BD Biosciences）插入到试管顶部。将细胞悬液通过细胞滤网进入 50 mL 锥形管中。 
12. 使用另外 5 mL DTI 冲洗试管，以收集任何剩余的细胞和表皮组织条。通过细胞滤网。
13. 取出并丢弃滤网。现在，50 mL 锥形管中的细胞悬液体积为 ~15 mL。
14. 通过以 180 × g 的设置离心 7–10 分钟，使细胞沉淀。
15. 小心吸出上清液，不要移动细胞沉淀物。
16. 将细胞沉淀物重悬于步骤1中制备的 10 mL EpiLife 补充培养基中。用 10 mL 移液器上下吸移 7-10 次，确保细胞悬液均匀。
17. 测定浓度（活细胞数/mL）并计算需要用包被基质进行处理的培养表面积。将剩余细胞悬液置于 4ºC 下直至需要使用。
    
    
    • 向含有 20 μL 台盼蓝溶液的无菌试管中加入 20 μL 来自步骤16的等份细胞悬液，并使用血细胞计数器测定制备液中的活细胞总数。
    • 对于从成人组织中分离的表皮细胞，以 2 × 10⁴ 个活表皮细胞/cm² 进行铺板；或者，对于新生儿组织，以 4 × 10³ 活表皮细胞/cm² 进行铺板。
    
    
18. 确定原代培养所需的培养瓶数量，并使用包被基质制备培养表面，如下文所述。
    
    
    • 获取并标记所需数量的培养瓶。
    • 每 750 cm² 待包被表面需要一个包被基质试剂盒。
    • 为每平方厘米 (cm²) 待包被表面添加 67 μL 稀释培养基。例如，向 T-75 培养瓶中添加 5 mL。
    • 向每个培养瓶的稀释培养基中直接添加 0.67 µL 包被基质/cm² 表面。例如，向每个含有 5 mL 稀释培养基的 T-75 培养瓶中添加 50 μL。
    • 彻底涡旋培养瓶以混匀并包被每个培养瓶的表面。室温下孵育30分钟。
    • 在真空条件下使用巴斯德吸管从培养瓶中吸出包被基质溶液。
      
      
19. 从 4°C 条件中取回表皮细胞悬液。
20. 将细胞悬液稀释到 EpiLife 补充培养基中，以获得适当体积和密度的活细胞用于接种原代培养物，然后接种到步骤18中制备的包被培养瓶。
21. 来回摇动每个培养瓶以确保培养瓶表面均匀包被，并在含 95% 空气/5% CO₂ 的 37°C 且湿度饱和的舱室中孵育。将原代培养物在不受干扰的情况下孵育至少48小时。

原代培养

初次孵育 48–72 小时后更换培养基，然后至少每48小时更换一次。使用上文中制备的培养基进行培养基更换。

当培养物融合度达到 ~50% 后，每天为每个 T-75 培养瓶添加至少 15 mL 培养基。当培养物融合度达到 ~80% 后，进行传代培养和/或使用 Synth-a-Freeze® (SAF) 冻存培养基冻存细胞，如下文所述。


原代角质形成细胞的传代培养

因为人角质形成细胞的原代培养物特别难以从培养表面释放出来，所以使用以下实验方案从原代培养物中收集角质形成细胞。下述实验方案适用于 75 cm² 培养瓶。如果使用规格不同的容器，请对实验方案进行相应调整。

1. 移除培养瓶中的培养基，向细胞层中加入 3 mL rTE，室温下孵育1分钟。
   
   备注：  不需要先用 PBS 冲洗细胞层，因为补充的角质形成细胞培养基不含血清，并具有超低浓度的 Ca++。
   
   
2. 1分钟后，移除 rTE 溶液，更换为 3 mL 新鲜 rTE 溶液。室温下再孵育2分钟。
3. 移除在步骤2中添加的 rTE，更换为 3 mL 新鲜 rTE。
4. 室温下继续孵育总计10分钟。
5. 在显微镜下观察细胞。当细胞变为完全圆形（12–15 分钟）时，用一只手握住培养瓶，用另一只手的指关节轻拍培养瓶侧面，使细胞从培养瓶表面释放出来。如果细胞未从表面释放，则继续再孵育两分钟并重试。请勿尝试通过朝手部或其他物体用力敲打来释放细胞。施加不必要的力可能会导致细胞裂解。
6. 从培养瓶中释放细胞后，将 5 mL DTI 溶液添加到培养瓶中，并用移液器将溶液吸到培养瓶表面以悬浮细胞并分散团块细胞。
7. 将细胞悬液转移至 15 mL 锥形离心管中。重复步骤 6–7。
8. 通过以 180 × g 的设置离心 7–10 分钟，使细胞沉淀。
9. 小心吸出上清液，不要移动细胞沉淀物。
10. 对于传代培养，请将细胞沉淀物重悬于 10 mL EpiLife 补充培养基中，并使用血细胞计数器测定细胞浓度。以 5 × 10³ 个细胞/cm² 的浓度接种新培养瓶。

原代角质形成细胞的冻存

1. 按照原代角质形成细胞传代培养步骤 1–9 进行操作。
2. 将细胞沉淀物重悬于3–5 mL Synth-a-Freeze 冻存溶液中。
3. 使用血细胞计数器测定细胞浓度。
4. 采用程控降温仪或其他合适的设备以 0.5–2 × 10⁶ 个细胞/mL 的密度冻存细胞，然后转移至液氮中储存（气相）。