原代肝细胞计数表


计数员  _____________________________                 肝细胞批号_________________________

日期  _____________________                                              项目 ID  ___________________


台盼蓝计数结果

象限活细胞+死细胞=总细胞
象限1 + = 
象限2 + = 
象限3 + = 
象限4 + = 
总计 + = 



细胞活力计算


活细胞            /              总细胞                     =                 活力 %
                             /                                                      =
________________________________________________________


总得率计算

总细胞    /    象限计数   x   稀释因子    x    10,000    x    当前体积 (mL)   =   总细胞得率
                       /                                          x                            2  x    10,000    x                                              =   x 106 个细胞


细胞形态注释


透明细胞质                    
圆形                  
透明/清晰的细胞膜            
极小碎片                     
细胞器肿胀
细胞膜起泡
脂滴
遍布碎片

备注:_________________________________________________________________________

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接种密度计算


总细胞得率                  /        所需密度*                       =              所需总体积
                  x 106 个细胞       /                           x    x 106 个细胞/mL    =                                                 mL


所需总体积         -       当前总体积               =               要添加至细胞储备液的体积
                                         mL -                                                      mL=                                                mL
                            

* 请参阅供应商的建议。对于24孔板,人铺板肝细胞的理想密度通常为 0.75 x 106 个细胞/mL、0.8 x 106 个细胞/mL 或 0.9 x 106 个细胞/mL。悬浮所用密度或其他物种的密度将有所不同。

 

叠加计算

所需 4°C 培养基的总体积*  x   最终凝胶浓度 / 初始蛋白质浓度  =  要加入 4°C 培养基的凝胶储备液体积
                                               
      mL x     0.35 mg/mL              /                                          mL =                                      mL

 

* 培养基需要置于冰上保持 4°C。我们建议 Williams 培养基 E(Life Technologies 货号 CM6000)与无血清维持培养添加剂包(Life Technologies 货号 CM4000)结合使用。
请参阅供应商的规格表。我们建议使用 Geltrex™ 低生长因子基底膜基质(Invitrogen 货号 12760-021),浓度为 0.35 mg/mL。

需要帮助?有关肝细胞产品的技术支持,请访问 www.lifetechnologies.com/hepatocytes
发送电子邮件至 hepaticproducts@lifetech.com,或通过以下电话联系我们:+1 866 952 3559(美国免费热线);+1 919 237 4500(收费热线);+44 (0)141 814 5900(欧洲)。

使用台盼蓝拒染分析法对原代肝细胞进行细胞计数

提前准备冻存肝细胞


注释:
处理原代肝细胞时请使用通用安全预防措施和适当的生物安全柜。

  • 在 37°C 水浴中快速解冻冻存肝细胞(<2 分钟),并立即在 37°C 解冻培养基中对细胞进行稀释。使用解冻培养基冲洗冻存管以去除所有细胞,然后低速离心以去除冷冻保护剂(请参阅供应商的指示)。例如,应将解冻的人肝细胞快速转移至 40 mL 37°C CHRM® 培养基(Life Technologies 货号 CM7000)中,并以 100 x g 的设置离心10分钟。
  • 使用预热至 37°C 的含血清培养基轻柔地将肝细胞重悬至浓度约为 106 个细胞/mL。对于要铺到胶原蛋白包被板上的肝细胞,我们建议使用添加了含血清铺板添加剂包(Life Technologies 货号 CM3000)的 Williams 培养基 E(Life Technologies 货号 CM6000)。


准备细胞计数样本瓶

 

  1. 将 200 μL 缓冲液(PBS 或类似溶液)或培养基与 50 μL 0.4% 台盼蓝染色液(货号 T10282)混合于 2.0 mL 圆底微量离心管中,以制备台盼蓝储备溶液。将 50 μL 稀释后的台盼蓝溶液转移到另一用于细胞计数的 2.0 mL 样本瓶(即细胞计数样本瓶)中。

  2. 在向计数样本瓶中加入肝细胞悬液之前,轻轻翻转肝细胞试管数次,确保悬液均匀。此步骤对于获得准确的细胞计数至关重要。

  3. 使用广口吸头将 50 μL 肝细胞悬液移入细胞计数样本瓶中,方法是通过一次抽吸将悬液吸入移液器吸头,然后将内容物分配到细胞计数样本瓶中。切勿冲洗吸头。否则会导致原始细胞悬液发生2倍稀释。

  4. 轻敲/轻拍计数样本瓶以确保混合物均匀。切勿剧烈摇动或搅拌,否则会导致细胞死亡,并导致细胞活力测定不准确。

    准备血细胞计数器

  5. 等待一分钟,再次轻敲/轻拍计数样本瓶进行混合,然后用移液管缓慢地将 10 μL 混合物移到血细胞计数器一侧的 V 形凹槽中。细胞悬液在毛细管作用下被吸到血细胞计数器中。

  6. 计数前,在显微镜下快速扫描象限,确保细胞均匀分布。如果血细胞计数器上样不均匀或含有气泡,请重新上样。

    肝细胞计数

  7. 立即对血细胞计数器四个外象限中的活肝细胞(透明或黄色)和死肝细胞(蓝色)进行计数,包括两条外象限线上的任何细胞(图1)。长时间暴露于台盼蓝会导致细胞死亡,因此请勿延迟计数。

  8. 在本页背面记录结果,并执行指示的计算以确定活肝细胞的总数。使用额外的含添加剂的铺板培养基或同等培养基,将肝细胞混合物稀释至所需的最终细胞浓度。


图1.在血细胞计数器上进行细胞计数。
将细胞-台盼蓝混合物上样到血细胞计数器一侧后对所有四个象限进行计数(在图 B 中圈出)。对象限线上的细胞进行计数时,应将2个边缘包括在细胞计数范围内,将另外两个边缘排除在外。 例如,在图 C 中,对接触顶部和左侧线的细胞进行计数(绿色圆圈),但不要对底部和右侧线上的细胞进行计数(红色圆圈)。

仅供科研使用,不可用于诊断目的。