冻存大鼠 Kupffer 细胞和大鼠 Kupffer-肝细胞共培养物铺板

注释：方案假定在所有接种密度下均使用24孔。对于其他的孔规格，需对接种密度进行调整。
注释：Kupffer 细胞单一培养物在添加了至少 2% FBS 且无皮质类固醇（例如地塞米松、氢化可的松）的培养基中生长较佳。
注释：如果对包含肝细胞的共培养物进行铺板，则在肝细胞铺板之前24小时进行 Kupffer 细胞铺板可获得较佳结果，但是您也可在 Kupffer 细胞铺板后 4-48 小时期间进行肝细胞铺板。

从冻存管进行 Kupffer 细胞铺板

1.收到订购物品后，请将冻存管储存于 -130°C 以下的液氮杜瓦瓶（气相）中。
2.解冻时，从杜瓦瓶中取出冻存管并在 37°C 水浴中解冻，直至冻存管中只剩一小块冰。
3.将冻存管中的内容物转移至置于冰上的 15 mL 锥形管中，缓慢添加 4°C Kupffer 铺板培养基直至体积达到 10 mL，以稀释样本。
注释：在 37°C 的生理温度下，Kupffer 细胞“粘性”很高。如果将培养基加热至 37°C，则 Kupffer 细胞将附着到包括锥形管壁在内的任何基底上；不建议在此步骤中使用预热培养基。
4.以 500 x g 的设置离心细胞5分钟。
5.使用小号血清移液管（推荐使用 1 mL 移液管）将沉淀细胞重悬于 1-2 mL 的 Kupffer 铺板培养基中。
6.采用台盼蓝拒染检测法进行细胞计数。
7.用 Kupffer 铺板培养基将细胞稀释至 0.2 x 10⁶ 个细胞/mL（适合炎症性 Kupffer/肝细胞共培养物）或根据内部方案稀释至所需密度。
8.对于24孔规格，对接种密度为 0.5 mL/孔的细胞进行铺板，然后将细胞置于加湿的 37°C/5% CO₂ 培养箱中，使其贴壁4小时。
9.贴壁4小时后，将培养基更换为 Kupffer 铺板培养基。
10.24小时后，将培养基更换为 Kupffer 维持培养基 - Kupffer 细胞培养物即可用于开始实验，或用于执行后续步骤已对 Kupffer 细胞/肝细胞共培养物进行铺板。
注释：要维持 Kupffer 细胞培养，每24
小时将培养基更换为 Kupffer 维持培养基

与肝细胞共培养

11.使用 Kupffer 铺板培养基，按照正常的大鼠肝细胞铺板方案将肝细胞接种到 Kupffer 细胞顶部。
注释：在使用肝细胞（冻存或新鲜）之前，需对肝细胞进行 Percoll 梯度离心（50:50 v/v 的 90% 等渗 Percoll:Kupffer 铺板培养基）。以 100 x g 的设置离心细胞10分钟。如果细胞回收率过低，可将离心力 g 提高至 120 x g。预计会观察到细胞活力增加而得率下降。使用脂多糖 (LPS) 处理后，需要通过此步骤获得尽可能纯的肝细胞，以便确立细胞因子基准水平。
注释：通过使用 10% 杜氏磷酸盐缓冲液 (10X)（Life Technologies 货号 14200-075）稀释 Percoll，制得 90% 等渗 Percoll。

推荐的大鼠肝细胞接种密度：
新鲜分离的大鼠肝细胞 — 24孔板，0.6 x 10⁶ 个细胞/mL
冻存大鼠肝细胞 — 24孔板，0.8 x 10⁶ 个细胞/mL
12.肝细胞贴壁（4-6 小时）后，将培养基更换为共培养维持培养基。
13.经24小时培养后使用细胞开展实验。

Kupffer 细胞活化

14.实验前向培养基中添加脂多糖 (LPS 1 ug/mL) 以活化 Kupffer 细胞（对于 Kupffer 细胞培养或共培养），以模拟24小时肝脏发炎状态。
注释：LPS 活化会很快引发变化，可在2小时内观察到形态变化（见图2）。

LT179      2012年6月15日