使用 SuperScript III CellsDirect cDNA 合成系统直接从细胞中合成 cDNA

系统概述

SuperScript™ III CellsDirect™ cDNA 合成系统是一种经过优化的试剂盒，可直接从哺乳动物细胞裂解物中合成第一链 cDNA，而无需先分离 RNA。裂解和逆转录在同一试管中进行，得到的第一链 cDNA 可直接用于克隆和 PCR。对于实时定量 RT-PCR，请参阅以下注释。
 
在传统的 RT-PCR 中，首先从细胞中分离出 RNA，这个程序非常耗时，会导致材料损失。使用 SuperScript™ III CellsDirect™ cDNA 合成系统，可在单管中将细胞裂解，并以尽可能少的操作量从裂解液中获得 cDNA，且无样本损失。添加 DNase I，以便在第一链合成前消除基因组 DNA。
 
该试剂盒已针对范围从10,000个细胞一直到单个细胞（通过系列稀释测量）的小细胞样本量进行了优化。使用 SuperScript™ III 逆转录酶确保从少量起始材料（少至 10 pg 总 RNA）中获得高特异性和高得率的 cDNA。
 
合成后，可通过 PCR 用特异性引物扩增第一链 cDNA，而无需中间有机提取或乙醇沉淀。
 
下图概述了相关程序：







对于从细胞裂解物中进行实时定量 RT-PCR (qRT-PCR)，我们建议使用 SuperScript™ III Platinum® CellsDirect™ 两步法 qRT-PCR 试剂盒（货号11737-030 和 11737-038）或 SuperScript™ III Platinum® CellsDirect™ 两步法 qRT-PCR 试剂盒（含 SYBR® Green，货号11738-060 和 11738-068）。这些试剂盒包括专为实时定量 qRT-PCR 优化的试剂和方案。
 
试剂盒的优势

此试剂盒具有以下优势： 

• 与在不同处理条件下生长的各种哺乳动物细胞类型相容
• 单管形式尽可能地减少了试剂损失、样本损失和处理时间
• 在第一链 cDNA 合成反应中使用总裂解物体积，从而用有限细胞数量提供更高得率，并允许检测罕见转录物
• SuperScript™ III 逆转录酶具有较低 RNase H 活性和较高热稳定性，在第一链合成反应中产生高得率 cDNA，从而提高灵敏度并增强罕见转录物的检测
• 生成优质 cDNA 以供在各种应用中使用，包括克隆和 PCR
• 方案简单，所需时间少于2小时

SuperScript™ III RT

SuperScript™ III 逆转录酶是 M-MLV RT 的工程改造版本，降低了 RNase H 活性并提高了热稳定性。该酶可用于在高达 55°C 的温度条件下合成 cDNA，相较于其他逆转录酶，可获得更高特异性、更高 cDNA 得率和更多全长产物。
 
由于 SuperScript™ III RT 不会受到核糖体和转运 RNA 显著抑制，因此可用于直接从总 RNA 高效合成第一链 cDNA。此系统中的 SuperScript™ III RT 浓度经过优化，可从细胞裂解物中的总 RNA 合成第一链 cDNA。
 
RNA 对照品及引物

本系统随附的 RNA 对照品由 HeLa 总 RNA (10 ng/µl) 组成。本试剂盒随附的正向对照引物和反向对照引物根据人 GAPDH 基因设计，可产生 1.18 kb PCR 产物。

介绍

在此步骤中，您可以在重悬缓冲液或重悬缓冲液/裂解增强剂溶液中裂解细胞，并进行 DNase I 酶切以从样本中去除基因组 DNA。
 
细胞类型和密度

此试剂盒已针对小细胞样本量（从1个细胞到10,000个细胞不等）进行了优化。此试剂盒的性能已使用多种不同的哺乳动物细胞系（包括 HeLa、COS-7、293、Jurkat、CV1 和 K562）进行了验证。细胞可在各种条件和处理方式下生长。可以使用任何类型的培养容器。
 
我们建议每次反应最多使用10,000个细胞。较高数量的细胞可能会抑制逆转录，导致得率下降和/或得到截断的 cDNA 产物。请确保所有与细胞接触的溶液和仪器都经无菌处理。始终采用适当的无菌技术，处理细胞时在层流通风罩内操作。
 
所需材料

用户提供以下材料：

• 裂解增强剂（可选；货号 11739-010）
• 生长培养基中的哺乳动物细胞培养物
• Coulter 计数器或血细胞计数器
• 离心机（用于使细胞沉淀）
• 预热至 75°C 的培养箱、水浴或热循环仪
• 胰蛋白酶（仅适用于贴壁细胞培养）
• 1X 冷磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)，不含 Ca++ 或 Mg++
• 0.2 ml 薄壁 PCR 管或96孔 PCR 板
• 冰
• 移液器

• 重悬缓冲液
• RNaseOUT™ (40 U/µl
• DNase I，扩增级 (1 U/µl)
• 10X DNase I 缓冲液
• EDTA，25 mM
• 可选：HeLa 总 RNA 对照品

1. 加入足够的胰蛋白酶，覆盖组织培养皿、培养板或培养瓶中的贴壁细胞（例如，10 cm 培养皿使用约 1 ml；T75 培养瓶使用约 3 ml）。
2. 在室温下或 37°C 培养箱内孵育5分钟。
3. 在显微镜下检查细胞脱附情况。如果细胞没有脱附，请轻拍培养盘或培养瓶使细胞脱落，或延长细胞孵育时间，在显微镜下每分钟检查一次。
4. 当所有细胞都已脱附后，加入含血清的培养基至最终体积为 10 ml（对于6孔和12孔板，加入 1X–2X 体积的培养基）。请注意，培养基必须含有血清才能使胰蛋白酶失活。
5. 用移液管轻轻上下吸动以混匀细胞，然后将细胞悬液转移到离心管中。
6. 以 200 x g 的设置对细胞离心5分钟使细胞沉淀。
7. 吸出培养基，用 5–10 ml 1X 冷 PBS 洗涤细胞沉淀物。
8. 以 200 x g 的设置对细胞离心5分钟使细胞沉淀。
9. 吸出 PBS，将沉淀物重悬于 500 μµl 至 1 ml 的 1X 冷 PBS 中。轻轻混匀细胞溶液。
10. 采集一小份的等份试液以确认细胞浓度为所需浓度。使用 Coulter 计数器以电子方式测定细胞密度，或者使用血细胞计数器室手动测定细胞密度。
11. 使用冷 PBS 调节细胞密度，使其处在 1–10,000 个细胞/µl 范围内。再次对细胞进行计数，以验证细胞浓度。
12. 向放在冰上的 0.2 ml 薄壁 PCR 管或 PCR 板孔中加入 10 µl 重悬缓冲液。然后加入 1 µl 裂解增强剂或 1 µl RNaseOUT™ (40 U/µl)。
13. 将 1–2 µl 的细胞（<10,000 个细胞）转移至 PCR 管/孔中。
    

对照：对于对照反应，向 PCR 管或 PCR 板孔中加入 1 µl HeLa 总 RNA 对照品而不是细胞裂解物。


14. 将管/板转移到预热至 75°C 的培养箱、水浴或热循环仪中，然后孵育10分钟。

对照：对于对照反应，孵育3分钟。


15. 孵育后，短暂离心以收集冷凝液并继续进行 DNase I 酶切。

可能需要更大体积。细胞应完全被溶液覆盖。
 
在更大容积的组织培养孔中裂解细胞可能需要更多的重悬缓冲液。货号 11739-010 提供更多的重悬缓冲液，其中包括 10 ml 重悬缓冲液和 1 ml 裂解增强剂。

 
在组织培养孔中裂解细胞

注释：   将细胞接种于组织培养孔中，使 10 µl 重悬细胞达到所需的浓度。
 
对于组织培养孔中生长的贴壁细胞，执行以下裂解程序。
 

1. 吸出每个孔中的培养基，用 1X 冷 PBS 洗涤每个孔。吸出 PBS。 
2. 向每个孔中加入重悬缓冲液或重悬缓冲液/裂解增强剂溶液（建议；参见第4页）。有关用量，请参见第5页中标题为“组织培养孔中的重悬缓冲液用量”的表格。缓冲液应覆盖孔中的细胞。
3. 将板放在冰上孵育最长10分钟。在此期间，定期轻拍培养板，并每 2-3 分钟在显微镜下观察细胞以了解其是否已脱附或爆裂。
4. 10分钟后，用移液管轻轻上下吸动细胞，以使剩余的贴壁细胞脱落。如果细胞难以脱附，则将培养板在室温或 37°C 下额外孵育5分钟，定期在显微镜下观察细胞。
5. 对细胞进行计数或根据接种密度估算细胞密度（10 µl 应包含 <10,000 个细胞）。
6. 将 10 µl 细胞悬液转移到 0.2 ml 薄壁 PCR 管或 PCR 板孔中。
7. 对照：对于对照反应，向 PCR 管或 PCR 板孔中加入 10µl 重悬缓冲液，然后加入 1 µl HeLa 总 RNA 对照品。
8. 向 PCR 管/PCR 板孔中加入 1 µl RNaseOUT™ (40 U/µl)。
9. 将管/板转移到预热至 75°C 的培养箱或热循环仪中，然后孵育10分钟。
10. 对照：对于对照反应，孵育3分钟。
11. 孵育后，短暂离心以收集冷凝液并继续进行 DNase I 酶切。

在此步骤中，您可以用 DNase I 处理细胞裂解物以降解任何污染性 DNA。
 

  1.    将来自步骤15（裂解贴壁细胞或悬浮细胞）或步骤9（在组织培养孔中裂解细胞）的每个管/板放到冰上（参见“裂解细胞”），然后添加以下组分：

  3.    在室温下孵育5分钟。 

 注释：   对于较大的样本量（>1,000 个细胞），可能会延长孵育时间（最长10分钟）。但是，孵育时间超过10分钟会大幅降低 cDNA 得率。

  4.    短暂离心，然后向冰上的每个管/孔中加入 1.2 µl 的 25 mM EDTA。用移液管轻轻上下吸动以混匀，然后短暂离心以收集内容物。

  5.    在 70°C 下孵育5分钟。

  6.    短暂离心并继续进行第一链 cDNA 合成。

所需材料
 
用户提供以下材料：

• 预热至 70°C 的热循环仪
• 冰
• 移液器

• Oligo(dT)20 (50 µM)
• 10 mM dNTP 混合物
• 5X RT 缓冲液
• RNaseOUT™ (40 U/µl)
• SuperScript™ III RT (200 U/µl)
• 0.1 M DTT
• RNase H (2 U/µl)

  2.    用移液管轻轻上下吸动以混匀，然后短暂离心以收集内容物。
 
  3.    将试管在 70°C 下孵育5分钟。短暂离心试管以收集冷凝液。
 
  4.    将试管放在冰上2分钟，然后添加以下组分： 

  5.    用移液管轻轻上下吸动以混匀，然后短暂离心以收集内容物。
 
  6.    将试管转移到预热至 50°C 的热循环仪内。孵育50分钟。
 
  7.    在 85°C 下对反应物灭活5分钟。
 
  8.    向每个试管中加入 1 µl RNase H (2 U/µl)，然后在 37°C 下孵育20分钟。

注释：  如果您将在终点 PCR 中扩增短靶标 (<1.0 kb)，则此步骤为可选步骤。
 
  9.    在冰上冷却反应物。
 
10.    将单链 cDNA 储存于 –20°C 下，或直接进行 PCR 扩增。

介绍

使用此试剂盒生成的第一链 cDNA 可直接用于 PCR 扩增而无需额外纯化。本部分提供了 PCR 和高保真 PCR 方案示例。

 
PCR 酶

对于扩增使用此试剂盒生成的第一链 cDNA，我们建议使用 Platinum^® Taq  DNA 聚合酶扩增 < 1.0 kb 的靶标，使用 Platinum^® Taq  高保真 DNA 聚合酶扩增 > 1.0 kb 的靶标。
 
Platinum^® Taq DNA 聚合酶是重组 Taq  DNA 聚合酶与可在环境温度下阻断聚合酶活性的专有 Platinum^® 抗体形成的复合物。在 PCR 循环中，其活性在 94°C 下的变性步骤后恢复，从而使 Taq DNA 聚合酶在 PCR 中实现自动“热启动”。PCR 中的热启动特性可提高灵敏度、特异性和得率，同时允许在室温下组装反应。使用 Platinum^® 抗体有助于降低 PCR 优化要求、缩短反应设置和处理时间以及降低污染风险，因此可改善长达 5 kb 模板的 PCR 结果。
 
Platinum^® Taq 高保真 DNA 聚合酶是重组 Taq DNA 聚合酶、热球菌属 GB-D 聚合酶以及 Platinum^® Taq 抗体的混合物。Platinum^® 抗体与 Taq  DNA 聚合酶形成复合物，可在室温下抑制活性，从而实现在室温下构建反应。活性在 94°C 下的 PCR 变性步骤后恢复，从而实现酶的自动“热启动”并可提高特异性、灵敏度和得率。
 
热球菌属 GB-D 聚合酶是一种具有 3’ 至 5’ 核酸外切酶活性的校正读码酶。Platinum^® Taq  高保真 DNA 聚合酶的酶混合物保真度是单纯 Taq  DNA 聚合酶的6倍，且无需优化即可扩增广泛靶标大小范围（高达 12 kb）内的简单和复杂 DNA 模板。

• 由于 PCR 是一种能扩增痕量数量 DNA 的强大技术，因此需采取所有适当的预防措施以避免样本污染。
• 退火和延伸条件取决于引物 Tm，每种反应的退火和延伸条件应单独确定。
• 如果 PCR 效率不高，则使用引物滴定法在 100 nM 至 500 nM（终浓度）范围内以 100 nM 增量重复该反应。

1. 将以下组分添加到置于室温下或放在冰上的 0.2 ml 或 0.5 ml PCR 管或 PCR 板孔中。对于多次反应，制备常用组分的预混液。



组分	体积	最终浓度
10X PCR 缓冲液（不含镁）	5 µl	1X
10 mM dNTP 混合物	1 µl	各 0.2 mM
50-mM MgCl2	1.5 µl	1.5 mM
正义链引物 (10 µM)	1 µl	0.2 µM
反义链引物 (10 µM)	1 µl	0.2 µM
来自步骤10的 cDNA	2 µl	--
Platinum® Taq DNA 聚合酶	0.4 µl	2.0单位*
高压灭菌蒸馏水	加至 50 µl	n/a


 

2. 混合管内的内容物，必要时可用 50 µl 矿物油或硅油覆盖。


3. 对试管加盖并短暂离心以收集内容物。


4. 在 94°C 热循环仪中孵育试管30秒至2分钟，使模板变性并激活酶。


5. 执行 30–40 个循环的 PCR 扩增，如下所示：
   
   变性      94°C 下持续 15–30 秒
   退火         55–65°C 下持续30秒
   延伸         72°C 下持续1分钟/kb


6. 循环后保持 4°C 的反应温度。 样本可储存于 -20°C 下直至使用为止。


7. 通过琼脂糖凝胶电泳分析产物并通过溴化乙锭染色进行显色。使用合适的分子量标准品。

1. 将以下组分添加到置于室温下或放在冰上的 0.2 ml 或 0.5 ml PCR 管或 PCR 板孔中。对于多次反应，制备常用组分的预混液。




组分	体积	最终浓度
10X 高保真 PCR 缓冲液	5 µl	1X
10 mM dNTP 混合物	1 µl	各 0.2 mM
50-mM MgSO4	2 µl	2 mM
正义链引物 (10 µM)	1 µl	0.2 µM
反义链引物 (10 µM)	1 µl	0.2 µM
来自步骤10的 cDNA	>1 µl	--
Platinum® Taq 高保真 DNA	0.2 µl	1.0单位*
高压灭菌蒸馏水	加至 50 µl	n/a


  * 1.0单位足以扩增大多数靶标。在某些情况下，可能需要更多的酶（多达2.5单位）。
 

2. 混合管内的内容物，必要时可用 50 µl 矿物油或硅油覆盖。


3. 对试管加盖并短暂离心以收集内容物。


4. 在 94°C 热循环仪中孵育试管30秒至2分钟，使模板变性并激活酶。


5. 执行 30–40 个循环的 PCR 扩增，如下所示：
   
   变性      94°C 下持续 15–30 秒
   退火         55–65°C 下持续30秒
   延伸         68°C 下持续1分钟/kb


6. 循环后保持 4°C 的反应温度。 样本可储存于 -20°C 下直至使用为止。


7. 通过琼脂糖凝胶电泳分析产物并通过溴化乙锭染色进行显色。使用合适的分子量标准品。

1. 为步骤10的每个对照反应制备 PCR 混合物。对于每个对照反应，将以下组分添加到置于室温下或放在冰上的无菌 0.2 ml 或 0.5 ml PCR 管或 PCR 板孔中： 




组分	体积
DEPC 处理水	38.1 µl
10X PCR 缓冲液（不含 Mg++）	5 µl
50 mM MgCl2	1.5 µl
10 mM dNTP 混合物	1 µl
正向对照引物 (10 µM)	1 µl
反向对照引物 (10 µM)	1 µl
来自 RNA 对照/ 阴性 RT 对照的 cDNA，步骤10	2 µl
Platinum® Taq  DNA 聚合酶（5单位/µl）	0.4 µl
最终体积	50 µl


 

2. 混合试管内容物。短暂离心以收集反应组分。


3. 将反应混合物置于预加热 (94°C) 的热循环仪中。执行预变性步骤：94°C 下持续2分钟。


4. 执行40个循环的 PCR：
   
   变性      94°C 下持续15秒
   退火          60°C 下持续30秒
   延伸          72°C 下持续1分钟
   
     注释：  对于缓慢升温的热循环仪，请遵循制造商的说明。


5. 完成后，维持 4°C 的反应温度。


6. 对于每份样本，各取 10 µl 并使用琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色法进行分析。对于对照样本，应显现一条对应于至少 25 ng 产物的 1.18 kb 谱带。对于阴性 RT 对照样本，不应显现任何谱带。

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