用于采集白细胞的血液成分分离方案

1. 为每份样本分配 1.2 ml RNAlater，置于 2 ml 管中 
   
   为每份样本分配 1.2 ml RNAlater，置于 2 ml 微量离心管中。
   
   对于预计 WBC（白细胞）含量高于正常值的样本（例如白血病血样），为每份样本准备2管 RNAlater。
2. 采集 2.5-10 ml 血样
   
   按照标准程序，采集 2.5-10 ml 血样，置于含抗凝剂（推荐抗凝剂为 EDTA 钠或钾盐）的管中。
3. 在室温下以 ~1500-2000  X g 离心样本 10-15 分钟。
   
   在室温下以 1500-2000  X g 离心 10-15 分钟，分离全血。此操作会将血液分离成上层血浆层、下层红细胞 (RBC) 层和包含 WBC 的薄界面（见图1）。
   
   虽然建议的程序是在采集后尽快对血液进行成分分离，但已从在室温储存1天后再进行成分分离的 EDTA 抗凝血液中回收到完整 RNA。
   
   注：在典型的临床离心机中，1500-2000 X g 约为 3000-3400 rpm。例如，在使用236转子和 2092S 载体的 IEC CL2 台式离心机中，离心转速 3000 rpm = 1560 X g，3400 rpm = 2000 X g。
4. 用移液管移除血浆，小心不要扰动 WBC
   
   
   
   • 使用一次性塑料移液管（例如，Falcon 货号357524）吸出血浆（上层），直至距离 RBC 约 1 mm 处（见图1）。可将血浆保留用于其他应用（例如，病毒颗粒的回收或血清学研究）或将其丢弃。 移除血浆时，请勿扰动 WBC 层（也称为血沉棕黄层），其在上层血浆层和下层压积 RBC 之间形成一层薄膜。WBC 计数特别高的样本将具有较厚的血沉棕黄层。
   • 排出移液管中的所有残留血浆后，再继续操作。
   
   
   
   
   
   
   
   
   图1.WBC 回收过程中的血样外观
   
   1.采集管中的全血
      
   2.离心后血液
      
   3.去除血浆后的 WBC 和 RBC
      
   4.WBC 的顶视图（血沉棕黄层）
   
   5.移取 WBC 后的样本顶视图


5. 通过吸取法回收 ≤0.5 ml WBC
   
   使用同一移液管，小心吸取暴露的 WBC 层，吸取体积约为 0.5 ml 或更小。以圆周运动方式缓慢吸取，将所有可见的血沉棕黄层物质吸入移液管中。预计 WBC 会受到底层 RBC 的一定程度污染。或者，使用细胞刷回收 WBC。


6. 将 WBC 置于含 1.2 ml RNAlater 的管中并混匀
   
   
   
   • 将 WBC 缓慢排入含 1.2 ml RNAlater 的管中。避免在样本中引入气泡。
   • 使用同一移液管回收所有可见的剩余 WBC，小心保持总体积 <0.5 ml（如果 WBC 超过 ~0.5 ml，则将超过 RNAlater 管的体积）。如果 WBC 体积超过 0.5 ml，则使用两支 RNAlater 管将样本分成2等份。
   
   
   重要信息：至少需要2体积的 RNAlater 才能稳定 RNA。   
   
   
   • 在 RNAlater 中上下吸取数次，以冲洗移液器。盖上管盖，然后通过涡旋或倒置充分混合 RNAlater 和 WBC。


7. 储存已稳定的 WBC 或使用 Invitrogen RiboPure-Blood 试剂盒继续进行 RNA 分离

这是该程序中的一个可能停止点；此时，已稳定的 WBC 可在环境温度（最高约 30°C）下储存最长约5天。如果要储存超过5天，则应储存在 -20°C 下。