使用 TRI 试剂从 LeukoLOCK™ 过滤器捕获的细胞中提取 RNA 的替代实验方案

说明和流程概述

本实验方案使用 TRI 试剂和二氧化硅过滤器，从 LeukoLOCK™ 白细胞去除过滤器（Ambion 货号1933）捕获的白细胞中分离总 RNA。调整用于将 RNA 与二氧化硅过滤器相结合的乙醇量，可决定是回收包括小 RNA 组分的总 RNA，还是回收已去除 microRNA (miRNA)、tRNA 和 5S/5.8SrRNA 等较小组分的 RNA。使用此实验方案回收的 RNA 的质量和纯度与使用 LeukoLOCK 总 RNA 分离系统（货号1923）观察到的结果相似，并且得率通常增加约 50%–100%。尚未使用通过此实验方案提取的 RNA 进行微阵列实验，但是如果在血液过滤后立即用 RNAlater 处理捕获的白细胞，预计 RNA 谱不会发生改变。

试剂/用品

• TRI 试剂（例如，Ambion 货号9738）
• LeukoLOCK 分离和稳定试剂盒，Ambion 货号1933
• 变性裂解液，Ambion 货号 8540G (100 ml)
• 无核酸酶水（例如，Ambion 货号9938、9930）
• 无核酸酶的 0.1 mM EDTA（例如，Ambion 货号9912，50 ml）
• 5 M 氯化钠（例如，Ambion 货号9759、9760G）
• 溴-3-氯丙烷 (BCP)（例如，Sigma 货号 B-9673 或 MRC 货号 BP151）
• 100% 乙醇，ACS 试剂级或同等纯度
• 离心柱，Ambion 货号 10051G（50个/包）；
• 洗脱管，Ambion 货号12480（100支/盒）
• 15 ml 一次性带盖锥形塑料管（例如，Ambion 货号12500）
• 无核酸酶的微量移液器吸头和微量离心管（例如，Ambion 货号12400、12648）
• （可选）DNAfree™ 试剂盒，Ambion 货号1906（50次反应/盒）

其他用品

• 含 EDTA 抗凝剂的采血管；我们推荐 9 ml Vacuette EDTA K3 (Greiner Bio-One #455036) 或 Venosafe EDTA K3 (Terumo #VF-109SDK)。这些管盖带有薄隔垫，比塞型管盖更容易刺穿。
• 10 ml 真空采血管，提供真空源并用作 LeukoLOCK 过滤器滤出液的接收管；推荐 10 ml 真空采血管 BD #366430 或 Terumo Venoject #VT-100SP
• 25 G x 5/8 英寸皮下注射针头（例如，BD #305122）和 ~16 G 皮下注射针头
• 5 ml 注射器
• 一次性塑料移液管（5 或 10 ml）和球形或机械移液器

1. 采集血样，并通过 LeukoLOCK 过滤器捕获白细胞

采集血样，并根据 LeukoLOCK 总 RNA 分离系统方案通过 LeukoLOCK 过滤器捕获白细胞。完成第 II.B 节中的步骤 1-3。样本采集以及白细胞捕获和稳定。（您可以从我们的网站 http://www.ambion.com/catalog/CatNum.php?1923 下载实验方案。）

LeukoLOCK 分离和稳定试剂盒（货号1933）随附的 CD 提供了此过程的视频。


2. （可选）用 3 ml PBS 冲洗过滤器
   
   为去除 LeukoLOCK 过滤器上捕获的红细胞和网织红细胞，请按照 LeukoLOCK RNA 分离系统方案的步骤 II.B.4，用 3 ml 1 X PBS 冲洗。
   
   


3. （推荐）用 3 ml RNAlater 冲洗过滤器
   
   为稳定所捕获的白细胞中的 RNA，请按照 LeukoLOCK 总 RNA 分离系统方案的步骤 II.B.4，用 3 ml RNAlater 冲洗过滤器。请勿排出 LeukoLOCK 过滤器中的残留 RNAlater，并且在取下注射器之前，请勿缩回注射器的柱塞。


4. 密封 LeukoLOCK 过滤器端口
   
   用 Transfer Spike（液体转移接头）的护套和螺帽密封 LeukoLOCK 过滤器端口。
   
   停止点含稳定白细胞的 LeukoLOCK 过滤器在室温下可储存最长3天，或在 –20°C 或 –80°C 条件下长期保存（数月）。

1. 去除 LeukoLOCK 过滤器中的 RNAlater
   
   如果含捕获细胞的 LeukoLOCK 过滤器已冷冻储存，则在继续操作前，先在室温下解冻约5分钟。
   
   从 LeukoLOCK 过滤器上取下封盖。将 3 ml 或 5 ml 注射器（柱塞缩回）连接到 LeukoLOCK 过滤器的入口，然后按下柱塞，排出过滤器和端口中的 RNAlater。
   
   通常，从 LeukoLOCK 过滤器中排出约 8-10 滴 RNAlater。
   



2. 用 4 ml TRI 试剂冲洗 LeukoLOCK 过滤器；将裂解物收集到 15 ml 管中
   
   在此步骤中，裂解通过 LeukoLOCK 过滤器捕获的白细胞，然后将裂解物从过滤器中冲洗出并收集到 15 ml 锥形管中。
   
   
   • 在5 ml 注射器中装入 4 ml TRI 试剂。可使用大规格针头提取 TRI 试剂；在继续以下步骤前，将针头从注射器取下。
   • 将含有 TRI 试剂的注射器连接到 LeukoLOCK 过滤器的入口（喇叭形），然后按下注射器的柱塞以用 TRI 试剂冲洗过滤器，将裂解物收集到 15 ml 锥形管中。该过程需要 5-10 秒。取下注射器，缩回柱塞，将其重新连接到过滤器上，按下柱塞，将滤盘中滞留的残留样本排出到 15 ml 管中。
   
   


3. 加入 800 μl BCP，用力振摇30秒，然后将混合物在室温下放置5分钟
   
   
   • 向裂解物中加入 800 μl BCP，盖上管盖。（或者，也可在步骤 2.b 中收集裂解物之前将 BCP 加入到 15 ml 管中。）
   • 盖紧试管并用力振摇制备物30秒。
   • 将样本在室温下储存5分钟。


4. 以 ~2,000 x g 离心10分钟后回收水相
   
   
   • 以 ~2,000 x g（注：在 Straight8 或 IEC 台式离心机中相当于 3,200 rpm）离心制备物10分钟。
   • 将水相（顶相）移至一支新的 15 ml 锥形管中。预计体积约为 2.5–2.6 ml。


5. 加入水/乙醇，用于分离总 RNA 或已去除小 RNA 组分的 RNA
   
   要分离总 RNA（包括小 RNA 组分）：
   
   测量水相体积（使用 15 ml 管上的校准标记），加入0.5体积的无核酸酶水并混匀。然后加入1.25体积的 100% 乙醇并再次混匀。例如，如果样本体积为 2.6 ml，则加入 1.3 ml 水，混匀，然后加入 4.9 ml 乙醇并再次混匀。制备物应均一且澄清或仅略微浑浊。要采用无法有效回收小 RNA 组分的条件分离总 RNA：测量水相体积，加入0.5体积的 100% 乙醇并混匀。制备物应澄清。
   
   


6. 通过离心柱过滤样本
   
   采用真空压力或离心法，通过离心柱（货号 10051G）过滤样本。由于与离心柱容量 (~700 μl) 相比，样本体积较大，因此采用真空压力更简单；下面提供了这两种方法的操作说明。
   
   真空过滤：
   
   
   • 对于每个离心柱，将一支 5 ml 注射器筒连接到真空歧管上的入口。
   • 将离心柱插入注射器筒并施加真空。
   • 使用 5–10 ml 移液管将制备物加入离心柱中，随着样本通过过滤器，缓慢加入更多样本。过滤所有制备物通常需要 1–2 分钟。
   
   离心：如果真空歧管/真空系统不可用，将离心柱插入洗脱管中，并将 ~700 μl 样本吸移到离心柱中。短暂离心 (~10 sec)，以过滤样本，然后弃去滤出液。重复此步骤，以过滤所有样本。
   
   


7. 用 750 μl 洗涤液1洗涤离心柱
   
   
   • 将离心柱放入洗脱管中，加入 750 μl 洗涤液1。
   • 在设定为最大转速的微量离心机中将离心柱组件离心 ~5-10 秒，或者直至所有溶液通过过滤器。（溶液通常会在离心机达到最大转速之前通过过滤器。）
   • 弃去洗脱管中的滤出液，将离心柱放入相同洗脱管中。
   
   


8. 用2份 750 μl 洗涤液2洗涤离心柱
   
   
   • 按照前一步骤中所述的方法，用 750 μL 洗涤液2洗涤离心柱。
   • 再用 750 μl 洗涤液2重复洗涤一次。


9. 离心离心柱以干燥过滤器
   
   


10. 用 200–250 μl 的预热 0.1 mM EDTA 洗脱 RNA
    
    
    • 将离心柱放入一支新的洗脱管中。
    • 向离心柱中的过滤器中心加入 200–250 μl 无核酸酶的 0.1 mM EDTA（预热至 80°C），盖好盖子，在室温下储存1分钟。
    • 以最大转速离心1分钟。RNA 将在洗脱管底部的滤出液中。丢弃离心柱。将洗脱的 RNA 储存在 –20°C 或 –80°C 下。
    
    


11. （可选）用 DNase 处理洗脱的 RNA
    
    （可选）如果需要，用 DNase 处理洗脱的 RNA，以去除污染性 DNA。我们推荐使用 Ambion 的 DNAfree™ 试剂盒（货号1906），以充分去除基因组 DNA 并简化 DNase 的灭活步骤。
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