RNA 基础知识：处理 RNA

使用 RNA 的研究人员知道 RNA 是一种快速降解的敏感分子。由于 RNA 的单链性质，它很容易被蛋白质灭活并靶向降解。核糖核酸酶 (RNase) 是一种无处不在的酶，可靶向 RNA 以降解到较小的组分中。使用 RNA 时的重要考虑因素包括防止 RNase 污染，如何正确沉淀和储存 RNA 以及如何确定 RNA 产量。

有多种方法可防止实验室中的 RNase 污染。无菌技术的优势包括：使用干净的手套和洁净的实验室涂层，保持试管和试剂瓶关闭，使用干净的 (无 RNase) 工作区，并确保您使用无 RNase 的用品，溶液和试剂。

• 处理任何试剂，反应容器或样品时，应始终佩戴清洁的手套。手套应经常更换，特别是在触摸冰箱手柄，门旋钮或任何实验室设备 (如移液器) 后。
• 在执行使用 RNase (例如核糖核酸酶保护试验和质粒纯化) 的程序时，应注意移液器不会受到事故污染。移液器侧面的金属吸头弹出装置是一个潜在的污染来源。在实验之间取出金属弹出杆并在实验之间用 RNase 去污溶液擦拭移液器，移液器棒和弹出器将有助于消除这一问题。
• 高压灭菌吸头、试管和溶液，有助于灭活 RNase。玻璃器皿可在 300°C 温度下烘焙4小时，而塑料器皿、管和大多数溶液可通过 DEPC 处理。
• 通过使用 RNase 去污试剂补充这些方法。它们可用于实验室玻璃器皿、塑料表面、台面和移液器。试剂可灌注到、喷涂或擦于表面，并在接触后立即工作。只需用蒸馏水冲洗两次经处理的实验室器皿，即可使用。

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为了确定您实验室中是否发生了 RNase 污染，我们可提供 RNase 检测试剂盒。这些试剂盒有助于研究人员快速识别污染的试剂和设备。

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为确保溶液不受 RNase 污染，可使用焦碳酸二乙酯 (DEPC) 处理。DEPC 与蛋白质的组氨酸残基反应，会使 RNase 失活。然而，它也可能与 RNA 反应，因此需要在使用溶液前通过热处理去除。

• 向浓度为 0.05-0.1% 的溶液中加入 DEPC (例如每升添加 0.5 – 1 mL DEPC)
• 搅拌或将 DEPC 振荡进入溶液并孵育数小时
• 可高压灭菌至少 45 分钟
• 含有伯胺基团的化合物，如 Tris (2- 氨基 -2- 羟基甲基 -1，3- 丙二醇) 将与 DEPC 反应，因此只应在 DEPC 处理完成后添加

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常见的实验室用品通常被忽略为 RNase 污染来源。这就是为什么使用无 RNase 实验室用品十分重要的原因，如移液器吸头和管。

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与实验室用品类似，普通实验室缓冲液，试剂和水被忽略为 RNase 污染的来源。许多缓冲液和试剂以无 RNase 形式提供。水也不含核酸酶 (不含 RNase 和 DNase)。

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沉淀 RNA 的主要有两种方法。研究人员通过酒精沉淀沉淀沉淀和纯化 RNA 的最常见方法。另一种沉淀 RNA 的方法是使用氯化锂。

用酒精 (乙醇或异丙醇) 沉淀 RNA 需要较低浓度的单价阳离子 (例如 0.2 M Na⁺，K⁺；0.5 M NH 4+) [1]。在对盐的浓度进行了调整后，通过添加2.5体积的乙醇或1体积的异丙醇并充分混合可将RNA沉淀，然后于–20°C下至少冷却15分钟。

异丙醇在 RNA 分离中的作用是沉淀 RNA。RNA 不溶于异丙醇和乙醇等醇。虽然异丙醇沉淀 RNA 的效率稍比乙醇差，但是在 NH⁴⁺ 存在的情况下，它却能比乙醇溶液更好地使核苷酸游离于溶液中，使其沉淀的 RNA 分开。在更高的 RNA 浓度下，RNA 沉淀速度更快，更完整。µg 10 μ g/ml 的 RNA 浓度通常可在数小时至过夜中沉淀，没有困难，但在较低浓度下，应添加载体核酸或糖原，以促进沉淀和最大程度提高回收率。

氯化锂 (LiCl) 是沉淀 RNA 的替代方法，其优势在于不沉淀碳水化合物，蛋白质或 DNA。LiCl 常用于去除与其他方法制备的 RNA 共纯化的翻译抑制剂。需要 2 – 3 M 的最终 LiCl 浓度来沉淀 RNA (添加等体积的 4 M LiCl，20 mM Tris-HCl，pH 7.4 和 10 mM EDTA)。请注意，无需使用酒精进行 RNA 的 LiCl 沉淀。应允许 RNA 在– 20°C 下沉淀；沉淀时间取决于 RNA 浓度。通常可安全地使 RNA 沉淀数小时至过夜。

离心收集 RNA 后，可使用 70% 乙醇冲洗沉淀物以去除痕量 LiCl。LiCl 有效沉淀长度超过 300 个核苷酸的 RNA。µg LiCl 可以有效沉淀稀释溶液中的 RNA，但这是一条值得拇指指的规则，RNA 浓度应超过 200 μ g/mL。

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总 RNA 产量可以在 260 µg 下用分光光度计进行测量，其中一单位吸光度值 (A260) 为 40 μ g/mL。

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RNA 大小标记用于可视化 RNA。该产品可被 EtBr 染色或生物素化，用于后续二级检测。

已知的 RNA 转录本和双链 DNA 标记也可使用多聚核苷酸激酶 (5 ' 末端标记反应) 或 Klenow 片段 (3 ' 灌装反应) 进行末端标记，并变性以用作标记大小标记。

其他 RNA 大小和迁移位置指南包括大多数上样缓冲液中存在的二甲苯青和溴酚蓝染料以及用于 Northern 分析的总 RNA 电泳过程中存在的 rRNA 物质。上样缓冲液中所含染料的迁移位置受凝胶百分比和成分 (变性与非变性) 的影响。核糖体 RNA 包括 80% 的总 RNA 样品。在使用 EtBr 或紫外阴影染色的 Northern 凝胶中，18S 和 28S 物种均可强烈可见。表 1 给出了几种不同脊椎动物的大小。

表 1.核糖体亚基大小的代表性真核生物

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RNA 标记可视化提示

RNA 可以通过多种方式储存，具体取决于短期或长期储存是否需要。RNA 在 –80°C 温度下通常可保持稳定长达一年，而不会降解。镁和其他金属催化 RNA 中的非特异性切割，因此如果 RNA 要储存并保持完整，则应通过添加 EDTA 来螯合。

对于 短期 RNA 储存：

• 无 RNase H₂O (含 0.1 mM EDTA)
• TE 缓冲液 (10 mM Tris，1 mM EDTA)

对于 长期 RNA 储存，建议使用 RNA 稳定试剂。RNA 稳定剂有助于在 RNA 样品采集或采集后保持 RNA 的完整性。

了解有关 RNA 稳定剂的更多信息

1. Wallace，DM。(1987) 核酸沉淀。酶学方法 152 ： 41-46。 
2. Chomczynski，P. (1992) 增溶甲酰胺可保护 RNA 不被降解。Nucleic Acids Research, 20:3791-3792.