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有效制备 RNA 是多种令人兴奋且信息丰富分析技术的必需基本技术，包括新一代测序、逆转录 qPCR（RT-qPCR）、northern 印迹分析和 cRNA 生产。转录组显示的保真度以及回收 RNA 的品质和数量将对结果分析产生重大影响。
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样品收集、处理和储存过程中的多种因素可对结果产生负面影响，应予以考虑。这些因素大致分为三类：
- 处理之前稳定样品
- 操作期间回收 RNA
- 未保护样品暴露于 RNase 中
实验室 RNA 制备最佳操作以及改善 RNA 纯化的 10 种方法
RNA 大小介于 20 核苷酸（nt）到 8 千碱基（kb）之间。如果需要从目标样品中提取特定或多种类型/大小的 RNA，RNA 分离程序需要进行特定修饰。因此，为所需 RNA 靶标选择最佳 RNA 分离方法至关重要，因为并非所有 RNA 分离试剂盒的方法都相同。查看不同 RNA 类型描述以及为获得最佳结果而推荐的相关 RNA 分离试剂盒。
有关类型总结，如下所示：
- MicroRNA（miRNA）-18-22 nt 小型非编码 RNA，作用于 RNA 沉默和基因表达转录后调控
- 小型非编码 RNA（例如，pre-miRNA，SnoRNA 或 piRNA）- 20-200 nt 长，涉及多个细胞过程
- 信使 RNA（mRNA）->200 nt；将 DNA 信息转录为组成蛋白质产物的氨基酸序列
- 转移 RNA（tRNA）-70-90 nt；在蛋白质翻译过程中将氨基酸转移至不断增长的肽链上
- 核糖体 RNA 或 rRNA（例如，5S、18S 和 28S）->200 nt；核糖体的 RNA 组分
- 总 RNA = 一种洗脱液中的所有 RNA 类型
若要分离完整、高品质 RNA， RNase 必须受强蛋白变性剂（如离液裂解液或苯酚衍生物）的保护，否则不能将其引入 RNA 制剂中。RNase 几乎随处可见，因此必须确保与纯化 RNA 接触的物品无 RNase 污染。所有表面（包括移液器、台式、玻璃器皿和凝胶设备）均应使用 RNaseZap RNase 去污溶液或 RNaseZap RNase 去污抹布等表面去污溶液进行去污。应始终使用无 RNase 污染的吸头、试管和溶液，并经常更换手套。
内源性 RNase 必须在组织收获和细胞死亡后立即失活，以防 RNA 降解。
3 种有效的方法可用于完成此项操作：
- 使用离液裂解液（例如 PureLink RNA mini 试剂盒或 TRIzol™ 试剂中提供的含胍盐的裂解液等）收集后，立即彻底匀浆样品。
- 使用液氮快速冷冻样品。确保组织块大小足以浸入液氮中立即冻结，以防 RNA 降解。
- 将样品放入 RNAlater 组织收集中：RNA 稳定溶液是一种无毒水性收集试剂，可稳定并保护完整、未冷冻的组织和细胞样品中的细胞 RNA。必须将组织样品切成薄片（0.5 cm），以便 RNA 随后在被 RNase 破坏之前迅速渗透组织。
RNA 分离方法多种多样，因此很难确定使用哪种方法。最简单、安全的方法为色谱柱方法，例如用于中低通量的 PureLink RNA Mini 试剂盒，或用于高通量样品处理需求的 PureLink Pro 96 试剂盒。这些步骤易于操作，非常适合处理多个样品。MagMAX mirVana 总 RNA 分离试剂盒采用顺磁粒子法，易于在磁性粒子处理设备上实现自动化，是处理高通量样品需求的理想选择。
当处理核酸酶（胰腺）或脂肪（脑和脂肪组织）含量高等难以处理的组织时，建议使用更严格且基于酚的 TRIzol 试剂 RNA 分离方法。
- PureLink RNA mini 试剂盒–适用于大多数样品类型的最佳且最简便的方法
- MagMAX mirVana 总 RNA 分离试剂盒–满足自动化高通量 RNA 分离需求的理想选择
- TRIzol 试剂–尤其适用于高 DNase 或脂肪含量的难以分离样品
PureLink RNA Mini 试剂盒色谱柱可高效分离高品质总 RNA，同时去除大部分基因组 DNA。通常，大多数要求使用动物组织或哺乳动物细胞系 RNA 的应用都不需要额外进行 DNase 处理。但是，对于不使用跨内含子引物或内含子很小甚至没有内含子的生物样品 qRT-PCR 基因表达分析等，可能需要完全去除残留污染 DNA。PureLink DNase Set 便于在 RNA 分离方案中进行柱上 DNA 消化。“柱上”操作直接使用 DNase 进行处理更为简单，与 RNA 分离后使用 DNase 处理相比，RNA 回收率更高。PureLink DNase Set 也可用于去除先前已纯化 RNA 中残留的 DNA。PureLink DNase Set 可用于“柱上”和 RNA 后纯化工作流程。
根据组织结构和生理状态不同，一些组织含有丰富的 RNA，而其他一些组织含有低量 RNA。良好的样品制备实验设计将防止许多样品制备陷阱，例如 1）起始组织量不足导致 RNA 产量低于预期值，2）RNA 柱或珠过载导致 RNA 品质和/或纯度较差，3）分离过程中使用了多于所需体积的 RNA 洗脱液，RNA 浓度稀释。执行 RNA 制备方法之前，了解要处理的组织数量将确保为您分离满足您应用目的的足量预期纯度 RNA。
下图可用于快速检查组织样品类型及其各自的 RNA 产量。
PureLink RNA mini 试剂盒和 MagMAX mirVana 总 RNA 分离试剂盒随附无 RNase 洗脱液，优化用于纯化 RNA 的存储。或者，对于其他 RNA 分离方法（例如 TRIzol 提取和乙醇沉淀），可以将 RNA 沉淀重新悬浮于专用储备液中，例如经认证无 RNase 缓冲液的 THE RNA 储备液，尽可能减少 RNA 的碱基水解。
纯化 RNA 可在 -20℃下短期储存。 但是，我们建议将 RNA 等份保存在 -80℃ 下供一次性使用，防止反复冻融对 RNA 的损害，并有助于防止意外 RNase 污染。
- 将 RNA 储存在 -20℃ 进行短期储存
- 将 RNA 储存在 -80℃ 进行长期储存
- 将 RNA 分装到多个试管中，尽可能减少反复冻融和意外 RNase 污染
RNA 分析需要一定的 RNA 起始量才能实现最佳反应。RNA 过多或过少都可能导致实验失败或数据错误，并可能错误解析结果。
如何测量 RNA 质量和含量：
- 紫外光谱法–评估 RNA 浓度和纯度的传统方法。在 260 nm 和 280 nm 波长处测量稀释 RNA 样品的 UV 吸光度，并根据这些测量值使用比尔-朗伯定律（预测吸光度随浓度的线性变化）计算核酸浓度。（有关更多信息，请点击链接：在大多数 RNA 分析方法之前，RNA 定量是极为重要且必要的步骤）。紫外光谱法是一种简单的测量方法，大多数实验室都配备分光光度计。Thermo Scientific NanoDrop One/OneC 微量紫外可见分光光度计还有另一个优势，仅需 1-2 µL 样品即可进行 RNA 定量（传统分光光度计需要的样品量更多）。
- Qubit 荧光计–荧光法是使用专门的荧光染料测量核酸的另一种选择。借助 Qubit 4 荧光计等 Qubit 荧光计设备，即使在浓度很低的 RNA 样品中，也可以使用高灵敏度 Qubit 测定法快速测量 RNA 含量、完整性和质量。
- 毛细管电泳分析–将基于传统凝胶电泳的 RNA 定量和定性测量转移为微流控芯片格式。这些系统除提供含量和质量测量外，还可自动进行大小分类。可以通过获得 RNA 完整性编号（RIN）来评估分离 RNA 的质量。
用于 RNA 质量测量的标准可接受测量
- A260/A280 比表示蛋白质污染水平。RNA 的可接受比为 1.8-2.0
- RNA 完整性编号（RIN）–表示 RNA 的整体“完整性”。理想情况下，RNA 分析技术建议使用最小 RIN 值为 7 的 RNA 样品。但是，某些分子技术（例如 qRT-PCR）可以耐受 RIN 值低至 2 的样品。
RNA 可以通过多种应用程序进行分析，例如 qRT-PCR、微阵列、总 RNA 测序、基于扩增子/靶向测序等。最佳操作是在 RNA 纯化之前了解 RNA 起始量要求，以便选择正确的方法并节省时间和样品。
要考虑的其他事项：
- 是否需要去除任何/所有残留的污染 DNA？如果是，使用 Purelink Dnase set 进行柱上 DNase 消化是去除 DNA 最简单、有效的方法
- 当使用 qRT-PCR 法进行分析时，引物是否针对单个外显子基因进行设计？如果是，使用 Purelink Dnase set 进行柱上 DNase 消化是去除 DNA 最简单、有效的方法
- 每个 RNA 样品始终包含一个“ -RT”对照，确保 RNA 为扩增 RNA，而非残留 DNA
掌握复杂的制备、分离和定量 RNA 方法将增强您了解分子生物学的能力。但是，对于某些分析来说，人们可能会回避分离所有 RNA 的必要，转而使用更简单、快速的细胞裂解方法，同时节省了时间和精力。Cells-to-Ct 就是这样一种选择。一种基于裂解物的创新样品制备方法，便于用户使用组织培养板直接裂解 10 至 100,000 个细胞。在短暂进行 5 分钟裂解和 2 分钟终止反应之后，可直接使用细胞裂解液进行下游逆转录酶（RT）和 qPCR 反应。该方法具有高通量和自动友好性，便于用户在 10 分钟内处理 96 个样品，无需 RNA 柱或磁珠、离心和加热操作，或昂贵的样品制备自动化系统。
仅供研究使用。不得用于人或动物的治疗或诊断用途。