细菌-宿主相互作用研究的困难

细菌病原体与宿主细胞相互作用后的基因表达研究尤为困难 (1, 2)。 换句话说，纯化足够量的高纯度RNA用于细菌转录组分析十分困难。 从感染组织或体外细胞培养物中收集细菌并纯化细菌RNA，且不改变其基因表达是首个困难的步骤。 此外，病变组织或器官中的细菌细胞数量通常较宿主细胞数量少。 即便是对宿主细胞进行体外感染，粘附或侵入细胞的细菌数量也较少。 因此，从真核细胞和细菌混合物中纯化总RNA，通常会获得大量的真核细胞RNA和极少量的细菌RNA。 通常没有足够的细菌RNA，无法在芯片上产生足够的信号。

首先保持RNA表达图谱

在宿主-病原体相互作用研究中，采用Ambion的RNAlater™“冷冻”RNA表达图谱并保护RNA的完整性是收集细胞前的第一步 (图2)。 感染组织或器官一旦离开宿主生物体，应立即浸于RNAlater中。 RNAlater将渗入细菌和宿主细胞膜内，并迅速灭活内源性核糖核酸酶及其他细胞酶，这样可以保持RNA完整且表达图谱不变。 对于培养的细胞，最好先去除培养基，然后将RNAlater加入培养瓶或培养板中，使所有细胞完全浸没。 使RNAlater浸泡约10分钟后收集细胞，用于RNA分离。 对于不贴壁的真核细胞，先离心收集细胞，然后将其彻底重悬于RNAlater中。 对于已粘附于宿主细胞上但未被内化的细菌，最好先冲洗细胞，然后加入RNAlater，去除未紧密粘附的细菌。


图2： 在细菌-细胞相互作用后，纯化细菌mRNA用于全基因组表达分析的推荐步骤。

从宿主-病原体混合物中提取细菌RNA

冷冻表达图谱并收集细胞后，从宿主-病原体细胞混合物中纯化RNA。 一种方法是采用标准裂解缓冲液从整个宿主-病原体混合物中提取RNA。 但如果不采用更剧烈的细胞裂解方法 (如声裂法)，可能无法裂解混合物中的细菌 (3)。 提高宿主-病原体混合物中的细菌RNA产量的一种更高效的方法是选择性裂解宿主细胞，去除宿主RNA和细胞碎片，然后采用适用于细菌的细胞裂解方法 (如Ambion的 RiboPure™ Bacteria试剂盒) 提取细菌RNA。上述方法的一个例子是由Grifantini et al. (4) 报道的，他们采用皂素介导的裂解方法 (1% w/v) 裂解上皮细胞，然后从贴壁的脑膜炎球菌中纯化RNA。 皂素介导的裂解方法还可用于释放红细胞内的恶性疟原虫 (5)，以及检测脑脊液中的细胞内病原菌 (6)。 皂素还可与RNAlater同时使用，在宿主细胞裂解过程中保护RNA表达图谱。 由于并不是所有的真核细胞都对皂素介导的裂解作用敏感，因此在采用该方法之前，应先对目标宿主细胞系进行评估 (参见边栏：皂素介导的带有细菌病原体的真核细胞的裂解，简短实验方案)。

对宿主细胞进行选择性裂解后，收集细菌并采用Ambion的RiboPure Bacteria试剂盒纯化RNA。RiboPure Bacteria是唯一含有进行细菌RNA的酚萃取和玻璃纤维过滤纯化所需的所有试剂的商用试剂盒。 它还可与RNAlater配合使用。 采用RiboPure Bacteria纯化的RNA具有极高的品质，适用于DNA芯片基因表达分析。

富集细菌mRNA

在芯片分析前为获得最佳cDNA合成和标记，可以从仍含有细菌的未裂解的宿主细胞中去除污染的真核RNA。 Ambion的MICROBEnrich™试剂盒 (正在申请专利) 专用于去除细菌和宿主细胞RNA混合物中的真核RNA。 MICROBEnrich试剂盒可与大量的真核RNA同时使用，即便混合物中存在少量细菌RNA (如在无法采用皂素介导的裂解方法裂解宿主细胞时)。

MICROB Enrich试剂盒采用一种新技术，可以选择性地从哺乳动物和原核RNA混合物中去除>90%的人、小鼠或大鼠总RNA。 剩余的细菌RNA可用于芯片分析等下游应用领域。 MICROB Enrich反应的规模可调 (至多100 µg)。 采用该试剂盒可以从哺乳动物/细菌RNA混合物中去除总共500 µg的哺乳动物RNA。 MICROBEnrich试剂盒一般可进行20次反应，每次反应包括含有至多25 µg小鼠、大鼠或人RNA的混合RNA样本。 为进一步富集细菌mRNA，可以采用Ambion的 MICROBExpress™试剂盒从细菌总RNA去除16S和23S细菌rRNA。MICROB Enrich步骤适用于Ambion的MICROB Express试剂盒，通过进一步富集细菌mRNA，去除细菌大亚基rRNA。

参考文献

  1. Sassetti C, Rubin EJ.(2002) 微生物毒力的基因组分析。 Curr Opin Microbiol 5： 27-32.
  2. Cummings CA, Rehlman DA.(2000) 利用DNA芯片研究宿主-微生物的相互作用。 Emerg Inf Dis 6： 513-25.
  3. Staudinger BJ, Oberdoerster MA, Lewis PJ, Rosen H. (2002) 正常和吞噬细胞氧化酶缺陷的人中性粒细胞吞噬的大肠杆菌的mRNA表达图谱。 J Clin Invest 110(8)： 1151-63.
  4. Grifantini R, Bartolini E, Muzzi A, Draghi M, Frigimelica E, Berger J, Ratti G, Petracca R, Galli G, Agnusdei M, Giuliani MM, Santini L, Brunelli B, Tettelin H, Rappuoli R, Randazzo F, Grandi G. (2002) 利用DNA芯片识别未知的B群脑膜炎球菌疫苗。 Nature Biotechnol 20： 914-21.
  5. Hsiao LL, Howard RJ, Aikawa M, Taraschi TF.(1991) 利用红细胞内恶性疟原虫改变宿主细胞膜的脂质成分。 Biochem J 274： 121-32.
  6. Gould FK, Freeman R, Law D, Moriarty T. (1988) 细胞内生物体检测中的裂解作用。 Lancet 2： 461.