哺乳动物细胞培养基础支持 – 问题排查

如果培养基配方中含有：

• NaHCO₃ (g/L) 浓度<1.5时,所需CO₂浓度为4%；
• NaHCO₃ (g/L) 浓度处于1.5-2.2时，所需CO₂浓度为5%；
• NaHCO₃ (g/L) 浓度处于2.2-3.4时，所需CO₂浓度为7%；
• NaHCO3 (g/L) >3.5时,所需CO₂浓度为10% 

*有个例外情况。Gibco™ DMEM一般遵照Dulbecco的原始配方，含有3.7g/L碳酸氢钠。用户在CO₂含量为5-10%的CO₂培养箱中使用此培养基已有数十年，通常可以维持生理pH值；这也与所培养的细胞类型有关。随着细胞不断生长，pH值开始不断下降（由于乳酸的代谢性积累）。

有许多原因都可能造成这样的后果：

1. 不正确的CO₂水平——可使用 Bacharach提供的Fyrite试剂盒来人工检测CO₂水平,检查培养箱上显示的读数是否与人工测定的数值一致。如果培养箱显示出监测读数，则需确定CO₂水平波动的结果。检查相关设置以确保CO₂水平设置于适合您所用细胞系的水平（通常处于5- 10%）。经常检查管线连接以防漏气。避免频繁开关培养箱门。
2. 培养箱中的温度波动——请在培养箱中放置一个精密的温度计来监控培养箱温度。
3. 两性霉素或其他预防性抗生素/抗真菌素使用浓度过高——请按照推荐浓度使用。
4. 湿度异常——检查水盘中的水量。湿度对于实现多种细胞和培养基的正常气体交换至关重要（即在湿度不足够高的条件下，对于多数培养合适的CO₂水平已经无计于事）。
5. 培养基渗透压异常——检查完全培养基的渗透压。大多数哺乳动物细胞可耐受260至350 mOsm/kg的渗透压。加入HEPES等试剂和药物可能会对渗透压造成影响。
6. 微生物污染——细菌和真菌污染通常易于观察；支原体污染的表征微弱，不易观察, 因此对细胞培养形态的严格监控和常规测试对于检测此类污染十分必要。
7. 使用错误的培养基——反复检查所用培养基是否准确地匹配您的细胞类型和培养应用。举例来说，请确保您所用的无血清培养基是专为无血清的培养而设计的；请确保以适当的浓度使用合适的筛选性药物；检查所用试剂的保质期；在合适的温度下将培养基储存于暗处。

不可。悬浮培养细胞将会快速缺氧，最后只能达到1-1.5 x 10E6/mL的细胞密度,重组产物的表达水平也会大大降低。我们推荐您使用带顶旋盖的锥形塑料摇瓶（不带棉塞）来培养这些细胞。这样就可将培养物保持在即无菌又能自由气体交换的环境内。

加湿操作仅对培养体积在35 mL以下的单层培养与悬浮培养物是必需的。对于体积超过35 mL的振荡或旋转培养物而言，无需进行加湿操作。

请参见下方可能原因和我们推荐的解决方案：

请参见下列常见原因，及相关问题的解决方案。

请参见以下pH快速波动的可能原因，及其建议的解决方案：

沉淀可能是由于去垢剂漂洗过程中残留的磷酸盐所致，后者可能会沉淀带电荷的培养基成份。在去离子蒸馏水中润洗玻璃器皿数次，之后再进行灭菌。如果培养基被冰冻了，尝试将其加热至37°C后通过摇动将沉淀溶解。如果仍有沉淀，请弃用此培养基。 

这最可能是细菌或真菌的污染信号。我们建议弃用培养基，同时尝试对培养物进行去污染处理。

如果细胞经胰酶过度消化，即可能发生此种情况。尝试使用更短时间或更低浓度的胰酶进行消化处理。支原体污染也可能造成此种问题。分离部分细胞培养物，并检测支原体感染。最后，检查培养基中的粘附因子。

尝试更换培养基或血清。比较培养基配方中葡萄糖、氨基酸及其他成份之间的差异。比较新旧批次的血清。增加细胞的初始接种量。最后，让细胞逐步切换到新的培养基。

绝大部分情况下支原体污染无法从培养物中去除，只能弃用。不过也许您的培养物具有独特性，您不希望丢弃而试图去除污染。环丙沙星和Plasmocin™据报导适合此种应用。如果对相关实验方案或应用感兴趣，请联系抗生素供应商或参考已发表的文献。请注意支原体很难从培养物中清除，而且容易扩散，所以请对受污染的培养物进行隔离处理，直至支原体被完全清除，另外您的实验室可能也需要彻底净化。

使用抗生素对培养物去污染

当不可替代的培养物被污染时，研究人员可能会试图控制或消除污染。

1. 用户需要确定污染的来源是细菌、真菌、支原体，还是酵母。请点击此处阅读更多信息，以了解每一种污染的特性。
2. 把受污染的培养物跟其他细胞系进行隔离。 
3. 使用一款实验室消毒剂清洁培养箱和层流柜，并检查HEPA过滤器。

高浓度的抗生素和抗真菌剂可能对一些细胞系有毒性。因此，需进行剂量效应测试来确定何种浓度水平的抗生素或抗真菌会造成毒性。这一操作对于使用Gibco™ Fungizone™一类的抗真菌剂或泰乐菌素一类的抗生素尤其重要。

下列操作为我们确定毒性水平和对培养物去污染的推荐步骤：

1. 对细胞进行分离，计数, 使用不含抗生素的培养基稀释将细胞稀释至常规传代的浓度。
2. 将细胞悬液分入多孔培养板或几个小培养瓶中。向每一培养孔中添加不同浓度的特定抗生素。举例来说，我们推荐以如下浓度测试Gibco™ Fungizone™试剂:0.25，0.50，1.0，2.0，4.0和8.0 µg/mL。
3. 每日观察细胞脱落，出现空泡，融汇度降低，细胞变圆一类的毒性效应。 
4. 一旦确定了抗生素的毒性浓度水平，就可使用比毒性浓度低一至两倍的抗生素浓度来培养细胞两至三代。
5. 在不含抗生素的培养基中培养一代。
6. 重复步骤4。 
7. 在不含抗生素的培养基中培养细胞四至六代，以确定污染是否成功被消除。

浓储存液中的L-谷氨酰胺在低温下易于发生沉淀。在37°C水浴中短暂加热储存液并辅以温和的摇动，就可溶解沉淀。在沉淀完全溶解之前不要使用本品。

在所有以GlutaMAX™双肽添加剂作为L-谷氨酰胺替代品的培养基中，谷氨酰胺的浓度都与原始配方中的L-谷氨酰胺浓度处于同等的摩尔水平。

是的。如果您怀疑发生了类似情况，请移去培养基并换用新的培养基。或者，您可以添加含有促生长成份的培养基。也可使用I或II型GlutaMAX™取代培养基中的谷氨酰胺，以避免谷氨酰胺被耗竭。 

我们会在常温下运输那些需要在冰箱中长期存放的培养基。我们对代表性的培养基配方进行了研究，结果表明这些培养基在室温下放置一周不会有问题。

通常情况下，加入血清后的培养基可使用三个星期。尽管没有正式的研究支持数据，这是我们研究人员的经验。

以干粉配制的液体培养基与相同配方的在售液体成品一样稳定。通常避光保存于4度冰箱可确保1个月的使用效果。

Gibco™ FBS未经预老化处理。当储存于2至8°C的条件下，血清中可能存在的各类蛋白与脂蛋白（如冷凝集素，纤维蛋白原，玻连蛋白等）会发生聚集，并且形成肉眼可见的沉淀或混浊。这并不会影响血清的使用性能。我们推荐您将FBS储存于–20°C，同时避免反复冻融。

多种原因可能导致FBS中出现絮状沉淀。最为常见的原因是血清中脂蛋白的变性。你可能会在血清化冻后观察到血纤蛋白——一种血清中存在的促凝蛋白。这并不会影响本品的使用性能。

如需去除絮状沉淀，请将血清移至无菌管中，以400 x g进行简短离心。之后把所得的上清液和培养基一并过滤。不要试图过滤含有絮状沉淀的血清，可能会堵塞滤器。

我们的研究结果显示在4°C条件下短时保存化冻的FBS，28天（之内）不会降低其生长或活性方面的效能。如需在4°C条件下将FBS保存更长时间，就需要逐案评估这一储存条件是否为必须。

CD FortiCHO™ medium has proven to be an excellent single-stream medium for CHO production, clone development, and banking. In our experience, CHO clones created and selected in CD FortiCHO™ medium can be put directly into Dynamis™ medium without any adaptation. 实际上，我们的工作提示这些细胞在 Dynamis™ 培养基中的生产能力与FortiCHO™培养基一样好甚至更好，应用于工艺研发和放大生产时也与FortiCHO™培养基同样稳定

配制一升Dynamis™培养基需要24.8克Dynamis™培养基粉末。

请参考如下的逐步适应步骤：如果您在切换至某一比例时培养时遇到问题，请以前面的比例进行传代2-3次。

1. 对培养在含5-10%血清的传统培养基或其他无血清培养基中的CHO细胞进行逐步适应培养时，请使用3×10E5–4×10E5 活性细胞/mL的接种密度。 
2. 使用Countess™自动细胞计数仪监控细胞生长情况，直至活性细胞密度达到≥1×10E6个细胞/mL。
3. 按照Dynamis™ AGT™完全培养基：原始培养基的溶液25:75的比例来稀释细胞。我们推荐以原始比例的培养基培养一份细胞备份，直至新比例的培养基获得成功。在每一次后续传代时，使用比例逐渐增加的Dynamis™AGT™ 培养基溶液稀释细胞（Dynamis™ AGT™完全培养基:原始培养基=25:75，50:50，75:25，90:10，最后是100%的Dynamis™ AGT™培养基）。每一步骤都可能需要数次传代，以获得稳定的生长效果。 
4. 在100%的Dynamis™ AGT™培养基中几次传代之后，活细胞计数在接种后3-4天内可达到至少2×10E6个细胞/mL，细胞存活率在85%以上。达到这一阶段，我们认为细胞完全适应了Dynamis™ AGT™培养基。

通常情况下，胰酶可在冰箱中保存一周。不过，这一时间长度也随着这一周内的加热次数和使用频率而变化。同时，它也与细胞粘附的紧密程度有关，胰酶在非冰冻条件下每天都会丧失一定的活性。

缩短胰酶消化的时间，或使用更少量的胰酶进行处理，也可换用Gibco™ TrypLE™ Select或Gibco™ TrypLE™ Express。使用2-5 mL细胞生长培养基稀释胰酶处理体系后，将细胞悬液移至15 mL离心管中。以100 x g离心5-10分钟。弃去上清液并使用2-5 mL新鲜培养基重悬细胞沉淀。确定细胞数量并按照常规方案将细胞接种入培养瓶，细胞应会正常贴壁。