原代细胞培养支持 - 入门

原代细胞是从活体组织（例如活检材料）中直接获取，并在体外培养的细胞。由于这些细胞经历极少的群体倍增，因此比连续（肿瘤或人工永生化的）细胞系更能代表其来源组织的主要功能成分，使原代细胞成为体内状态更具代表性的模型。

通过使用不同种属来源的原代细胞，您可了解人类与临床前测试物种之间可能存在的差异。在开展体内研究之前，可使用小鼠或大鼠细胞摸索用量并减少临床前毒理实验所需的动物数量。人细胞可用于确定从动物模型外推所得人类数据的准确性。

当从组织分离得到的细胞进行原代培养时，如果这些细胞在离体条件下进行增殖，形成汇合的单层细胞或密集的细胞悬液。按照传统的定义，经首次收获和传代后的细胞群体即构成了一个细胞系[Freshney, R.I.（1987）。动物细胞培养基本技术手册（New York, Alan R. Liss, Inc.）]。这一类细胞系具有有限的寿命，在此期间具有最高生长能力的细胞将占据主导地位，导致细胞群体在基因型和表型上达到一定程度的均一性。

基于这一命名系统，连续细胞系即为一个经历了基因转化，具有无限生长潜能的细胞群体。连续细胞系通常为非整倍体。在实际操作中，连续细胞系可承受极高传代次数的培养，尽管在经历非常多的传代后，可能会发生一些进一步的基因型乃至表型的改变。永生化可自发形成，亦可由病毒或化学诱导产生。请牢记在不同的研究组之间，这些术语的定义可能会有变化。许多研究人员不使用“细胞系（cell line）”一词指代任何细胞类群，除非该群体经过基因转化。

细胞株（cell strain）是细胞系的一个亚群，可通过克隆或某些其他手段从培养物中正向筛选得到。一个细胞株通常在其原始细胞系基础上发生了进一步的基因改变。举例来说，某一细胞株的成瘤性相对其原始细胞系可能变强或变弱，也可能在经历转染步骤后最终变成一个独立的细胞株。

细胞类型（cell type）一词意指拥有共同表型的所有细胞，例如角质形成细胞，黑素细胞等。因此从大量不同供体分离得到的角质形成细胞均属同一细胞类型。

“正常”意味着分离培养的原代细胞来源于正常健康组织，而非疾病组织。依据上述的传统定义，“正常”也可能是一个对立于连续细胞系的概念，意指组成细胞系的细胞群体未经遗传改造，不具有无限生长潜能。

群体倍增是培养体系中细胞总数的翻倍过程，在指数或“对数”生长期最为常用。

传代数目是指将细胞群体从培养容器中取出和传代的次数，这是为了将细胞保持在足够低的密度，以促使其进一步生长。在Invitrogen™细胞培养的定义中，组织分离得到的细胞的首代培养物称为原代培养。首次传代后的细胞称为第二次培养物（或第1次传代， passage 1）。第二次传代后的细胞则称为第三次培养物（或第2次传代，passage 2），以此延续下去。

请参见我们详细的实验方案来使用血细胞计数板计数细胞。

下列步骤以单管冻存细胞进行培养的实验方案为例。

1. 准备一烧杯37°C的水。
2. 从液氮储存中取出一管细胞，注意保护手和眼睛。
3. 拧松管盖1/4圈，等待10秒钟以释放螺纹中可能残留的液氮，再重新拧紧管盖。
4. 将冻存管的下半部分置于37°C水浴中进行解冻，直至冻存管内仅剩余一小块冰芯，使细胞迅速解冻。
5. 用消毒液擦拭管体外表面，再将其移至II级A型层流细胞培养通风橱中。
6. 打开管盖，使用1 mL移液器上下吹打细胞悬液以分散细胞。
7. 从管中吸取20 uL细胞悬液，并将其稀释于20 uL台盼蓝溶液中（如：Gibco™台盼蓝，货号 15250-061）。
8. 使用血细胞计数板来确定每毫升悬液中的活细胞数。
9. 将管中悬液（1 mL）稀释至产品说明中的推荐浓度（例如1.25 x 10E4活细胞/毫升，Gibco™ 新生人表皮角质形成细胞）。
10. 将5 mL细胞悬液加入25 cm2培养瓶，或将15 mL细胞悬浮液加入75cm2培养瓶中。
11. 摇匀培养瓶中的培养基以彻底分散细胞。许多类型的细胞都会迅速贴壁，如果没有在传代后即刻摇匀细胞，细胞可能生长不均匀。
12. 在37°C、5% CO2/95%空气、湿度细胞培养箱中培养细胞。为了获得最佳结果，培养开始后至少在24小时之内不要扰动细胞。

我们不推荐在种板前离心细胞以去除冻存培养基。尤其是在不适当的高速条件下，离心对细胞有损伤。以我们Invitrogen™细胞培养实验室目前经验的来看，如果DMSO的浓度足够低，不会对细胞造成伤害。因此，我们的产品说明中提供了一份详细方案，其中包括如何使用推荐的接种密度和培养基的体积稀释细胞使得DMSO的终浓度低于0.4%（v/v）。

当从Thermo Fisher Scientific购买了Gibco™或Invitrogen™冻存或正处于增殖期的细胞，可对其进行扩增和重新冻存。不过，冻存操作可能会对细胞的生长状态有所影响。下列实验方案为您提供了一份使用Synth-a-Freeze™培养基冻存细胞的基础指南，Synth-a-Freeze™培养基是Thermo Fisher Scientific旗下的一款成分确定，无蛋白成份的冻存培养基。

请注意：由于冻存设备与个人技术之间的差异，我们无法保使用本方案冻存的细胞在复苏后能够保持活力，我们也无法为研究用户实验室冻存细胞的效果进行担保。

1. 使用37°C水浴化冻Synth-a-Freeze™培养基或4°C条件下过夜化冻。
2. 如果在水浴中进行化冻，请确保温度不要超过37°C，也勿将该产品延长时间置于37°C。
3. Synth-a-Freeze™培养基在使用前应置于4°C条件下彻底平衡。为获得最优结果，推荐客户使用能够控制变温速率的冰箱。如果缺少能够控制变温速率的冰箱，也可使用细胞冻存盒（如Thermo Scientific™ Mr Frosty™ container)。
4. 如需用酶试剂解离培养器皿表面的细胞，则需使用对应的终止溶液重悬细胞以中和酶的效果。
5. 通过离心沉淀细胞。
6. 去除上清液后，使用预冷的Synth-a-Freeze™培养基以5x10E5至3x10E6细胞/毫升的密度重悬细胞。
7. 将细胞悬液分装至合适数量的冻存管中。
8. 将细胞尽快冷却至4°C。
9. 如果使用控制变温速率的冰箱：以每分钟降低1°C的速率冰冻样品，直至–40°C。之后按照每分钟降低2°C的速率降至–90°C左右。
10. 如果使用细胞冻存盒：请按照说明书来准备冻存盒。

为获得最佳结果，我们推荐您在细胞温度降至–80°C后，尽快将冻存管转移至液氮储存设备的气相中。

作为Synth-a-Freeze™培养基的替代品，可使用该冻存细胞推荐的基础培养基，添加10%胎牛血清（FBS）和10% DMSO进行细胞冻存。请注意不推荐将Synth-a-Freeze™培养基用于人表皮黑素细胞的冻存操作。

可在180 x g（相对离心力，RCF）条件下离心细胞。您可通过测量转子的最大半径并将信息数值输入此网站的表格中计算准确的转子转速。举例来说，使用15厘米半径的转子，以180xg（RCF）的相对离心力离心细胞，您就需要1036 rpm的转速。

是的，我们从组织中分离原代细胞需要使用酶进行消化。

不可以，不能使用冻存的组织。

这一参数随着供体年龄、组织大小、位置及我们的设备条件而发生着很大变化。某些情况下，少量组织即可分离很多细胞；而某些情况下，大量组织只能取得少量细胞。通常情况下，我们可获得30-300管细胞。

通过每一培养物的接种密度和收获密度来计算累计群体倍增水平。 

We use Medium 106 and LSGS.

下列图片展示了使用Click-iT™ Edu Alexa Fluor™ 488成像试剂盒、抗alpha微管蛋白抗体和山羊抗小鼠Alexa Fluor™ 555二抗与Hoechst™ 3342染料共同制备的HCEC图像。

我们推荐在无血清的角质形成细胞培养基（KSFM）中培养HCEC细胞，这些细胞也是使用这款培养基生产和质控的。不过，如果需要成份明确的生长系统，我们推荐您使用成份确定的KSFM培养基（Defined Keratinocyte-SFM）。请注意 

在成份确定的KSFM培养基中培养HCEC细胞时需要使用基质包被试剂盒（Coating Matrix Kit）。内部测试显示KSFM与成份确定的KSFM培养基中培养的HCEC细胞具有相似的生长速率和形态。

使用KSFM或成份确定的KSFM培养基培养HCEC时无需饲养层细胞。然而，使用成份确定的KSFM培养基培养HCEC细胞需要使用基质包被试剂盒（重组I型胶原）才能有效贴壁和生长。

在推荐条件下培育时，KSFM中生长的HCEC细胞通常每天能够达到0.75-1.0左右的群体倍增速度。使用成份确定的KSFM培养基也能够达到相似的生长速率。

在推荐的培养条件下，以5000个细胞/cm2的密度接种的HCEC细胞通常在5–7天的时间内达到90%左右的汇合度。

每一批次的HCEC细胞均通过了已被广泛认可的角膜上皮标志物——p63α与细胞角蛋白15（CK15）——的阳性表达测试。

HCEC是从正常人体角膜-巩膜组织中分离得到的细胞。剪下的角膜缘区经酶消化后，对释放出的上皮细胞进行培养。使用能够控制变温速率的冰箱和含有10%二甲亚砜（DMSO）的冻存液冻存处于第二次培养（第1次传代，p1）后期的HCEC细胞。

经测试，复苏后的HCEC细胞可确保达到≥12次群体倍增。通常情况下，以5000个细胞/cm²的密度铺板的HCEC细胞可以传代3-4次。

对BacMam（重组杆状病毒编码的哺乳动物表达框）导入技术的内部评估结果显示其在HCEC细胞中高效表达。包含了CellLight™荧光蛋白-信号肽融合产品及其他BacMam生物传感器（biosensor）产品在内的BacMam 2.0试剂通常在优化的条件下可达70%以上的转导效率。

HCEC通常具有椭圆状的典型形态，同时在单层培养细胞中还会观察到多种共同生长的上皮细胞。您可参考HCEC产品页中达~90%汇合度时的代表性细胞相差成像照片。经持续传代后，观察到细胞形态改变是正常的，其中包括平均细胞大小的显著增加。细胞也可能变得更为扁平和出现裙状结构。在高代数的细胞中，通常会观察到有丝分裂指数或生长速率降低的情况。

请参见下列相差图片中的培养的人新生儿皮肤成纤维细胞（HDFn）：

第3天 - HDFn

第5天 - HDFn

第7天 - HDFn

HDFn细胞生长于加入了低血清生长添加剂（Low Serum Growth Supplement）的106培养基中。

请参见下列图片所示复苏并培养于含2%马血清的DMEM中 48小时后的细胞形态。

请参见下方图片中显示的经生理水平的TGF-β1与IGF-1刺激的Gibco™ 人骨骼肌成肌细胞。TGF-β1的加入抑制了细胞的分化，而添加IGF-1（货号 PHG0075）则会减弱此效应。本次实验中使用了抗肌钙蛋白染色法。

它们是同种细胞。角质形成细胞也称为基底细胞或基底角质形成细胞。

这些信息会显示在COA中。

我们推荐用户在所有应用无动物源性（APF）产品培养HEK细胞的实验中，选用这款试剂盒包被培养板。

每一批细胞均经过倍增时间测试，相应测试结果记录在COA中。

这些是衰老细胞，在成体角质形成细胞培养物中很常见。通常情况下培养物中会有一群衰老而不再增殖的细胞。而年轻细胞的个体更小，仍能够继续分裂。当培养物逐渐衰老，您就会观察到越来越多的大体积细胞，培养物最终也将停止生长。在正确培养和维持的情况下，这些培养物至少能够完成25次的群体倍增。

下列图片展示了汇合的单层角质形成细胞。

请参见下方图片所示的在加入了低血清生长添加剂（LSGS）的200培养基中培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）。

第3天 - HUVEC

第5天 - HUVEC

第7天 - HUVEC

我们提供人主动脉内皮细胞（HAEC），人肺动脉内皮细胞（HPAEC）和原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC）。

下列图片是我们在加入了HuMEC生长添加剂的HuMEC培养基中培养的人乳腺上皮细胞（HMEC）。

第1天 - HMEC

第3天 - HMEC

第5天 - HMEC

是的。HMEC是从正常人体乳房缩小成形术所获得组织中分离得到的细胞。

HMEC细胞在复苏后可确保完成至少16次群体倍增。

通常在保质期内，HMEC的群体倍增时间为24-30小时。

在推荐的传代条件下，一次传代相当于4次左右的群体倍增。

3D培养，BacMam基因导入技术，转染以及免疫细胞化学染色（ICC）等实验步骤均可在此处找到。

这两种培养基均为HMEC的培养而专门设计。不过，内部研究显示在HMEC的生长速率和培养时间两个方面，HuMEC即用型培养基（Thermo Fisher Scientific货号12752-010）的性能均比M171/MEGS（Thermo Fisher Scientific货号M-171-500/S-015-5）更优。当使用非直接免疫细胞化学染色法（ICC）进行细胞特异性标志物的染色时，两种培养基之间并无差别。

单管细胞（500,000个活细胞）能够以以每平方厘米2500个活细胞的密度接种八个T-25培养瓶。应使用血细胞计数器对细胞进行精确计数，从而确保达到一个合适的接种密度。

这一培养实验并不难。在标准的组织培养塑料器皿中，HMEC培养很容易以每平方厘米2.5 x 10E3个细胞开始，并通过胰酶/EDTA溶液进行传代操作。

下方图片中展示了加入人黑素细胞生长添加剂的253培养基中生长的HEMa细胞（复苏后首次培养）：

第5天 - HEMa

第9天 - HEMa

第14天 - HEMa

不要使用Synth-a-Freeze^™冻存培养基来冻存黑素细胞。我们推荐您使用含10% FBS与10% DMSO的DMEM培养基，或Recovery细胞冻存培养基（Cell Culture Freezing Medium）来冻存细胞。

请参见下方图片中，在加入微血管生长添加剂和粘附因子的131培养基中生长的HMVECad细胞（复苏后首次培养）：

第3天 - HMVECad

第5天 - HMVECad

第7天 - HMVECad

原代大鼠皮层与海马神经元是（分别）从Fisher 344型大鼠第18天胚胎（E-18）皮层或海马组织中分离得到，并直接冻存的。

细胞复苏4天以后即可观察到神经突触延伸。细胞培养时间越长，神经突触延伸越长。

这些细胞的培养时间可长达数月。不过，它们不会增殖，冻存操作也无法使其增殖能力恢复。

神经元一旦暴露于空气中，就会造成细胞死亡以及总体存活率低。

Gibco^™人星形胶质细胞是从胎儿大脑（怀孕17-24周）中分离出来的，并于第一次传代后进行冻存。该细胞具有组织特异性。供体信息（如可提供）会在COA（Certificate of Analysis）中注明。

人星形胶质细胞的增殖代数有限。在推荐的培养基中该培养物的细胞数量能够在超过10天的时间里增殖3-15倍。不过，我们不推荐在首次复苏后再对细胞进行冻存。

不可以。这些细胞必须生长于Geltrex^™基质包被的组织培养容器中。

大鼠皮层星形胶质细胞是从SD大鼠胎鼠（E-19）的皮层中分离得到的。这些细胞在第一次传代时冻存于含10% DMSO的生长培养基中。

大鼠皮层星形胶质细胞能够在培养条件下扩增至少一代。在推荐培养基中该培养物的细胞数量能够在超过10天的时间里增殖3-15倍。为帮助您在实验中获得稳定的结果，我们推荐您使用三次传代（P3）以内的细胞开展实验。如果您培养的细胞传代次数超过三次，我们推荐您在开展进一步实验之前再进行一轮鉴定。

这些细胞随时都可能粘附于细胞培养皿和离心管的塑料上。因此，在使用前，所有将与细胞接触的材料均应使用培养基进行润洗，以防止细胞粘附于塑料上。

大鼠胶质前体细胞是从出生2天的新生Sprague Dawley大鼠皮层中分离得到的，并于第2次传代时进行冻存。

这些细胞可在应用于实验前复苏并传代一次。单次传代可将复苏细胞的数量增加2倍。这些细胞经过复苏后的首次传代后，就不会再显著地扩增了。

Neurobasal培养基专门针对胚胎神经元和出生前神经元的培养体系进行了优化。Neurobasal-A培养基专为培养出生后神经元与成年脑神经元进行了优化。这两类培养基仅在渗透压上有所区别。

• 做为一般性的参考方案，我们推荐您使用Gibco™ B-27™添加剂来培养神经干细胞，海马及其他类型的CNS神经元。
• 对于来自PNS和CNS中的神经母细胞瘤或有丝分裂后的神经元，可添加Gibco™ N-2添加剂。
• 对于原代胶质细胞（星形胶质细胞）或具有星形胶质细胞表型的肿瘤细胞系（星形胶质细胞和胶质细胞瘤），或少突胶质细胞，可使用Gibco™ G-5添加剂。

黄色是由维生素成份所带来的。

我们针对此项应用提供了Gibco™ Hibernate™培养基产品。当加入Gibco™ B-27™添加剂与Gibco™ GlutaMAX™-1添加剂时，此培养基能够允许用户在大气环境CO2条件下操作神经元至少48小时，同时保持其活力；也能够在4°C储存条件下保持脑组织的活力长达一个月。我们提供两种Hibernate™培养基：

• Gibco™ Hibernate™-A培养基（货号 A1247501）专为出生后神经元而配制。
• Gibco™ Hibernate™-E培养基（货号 A1247601）专为胚胎神经元而配制。

这两类培养基仅在渗透压上有所不同。

当神经元细胞成熟时，L-谷氨酸具有兴奋毒性。对于原代海马神经元及其他种类的胚胎神经元而言，我们推荐您在原始种板的培养基中加入 25 µM L-谷氨酸。不过，4天之后就不应添加L-谷氨酸成份了，因为超过4天后L-谷氨酸对神经元细胞具有毒性。

对于神经母细胞瘤，L-谷氨酸应添加于种板的培养基及后续换液培养基中。

我们提供下列B-27添加剂产品，这些产品均为满足特定应用而进行研发。

Gibco™ B-27™无血清添加剂（货号17504044）：适合长期培养并保持神经元活性的完全配方。

• Gibco™ B-27™无抗氧化剂型添加剂（Supplement minus AO）（货号10889038）：未添加五种抗氧化剂。该添加剂是研究氧化损伤，凋亡，或神经元出现自由基损伤等相关应用的理想选择。
• Gibco™ B-27™无胰岛素型添加剂（Supplement minus insulin）（货号A1895601）：去除了胰岛素。本品是研究胰岛素分泌与胰岛素受体的理想之选。
• Gibco™ B-27™无维生素A型添加剂（Supplement minus Vitamin A）（货号12587010）：去除会导致神经分化的维生素A成份。本添加剂是研究干细胞增殖的理想选择。

我们同时也为电生理实验准备了Gibco™ B-27™添加剂电生理试剂盒（B-27™ ElectrophysiologyKit，货号A1413701）。

B-27电生理试剂盒专门针对电生理实验进行了优化能够提升神经网络的放电率。其中所包含的附加成份能够帮助增加放电率和促进突触生成。

请参见下列图片中，培养于231培养基与平滑肌生长添加剂中的HASMC细胞：

第5天 - HASMC

第7天 - HASMC

第9天 - HASMC

这是参与止血过程的一类血液糖蛋白。该蛋白在血管内皮细胞、巨核细胞和内皮下结缔组织中持续表达，并稳定存在于血浆之中。血管性血友病因子在凝血过程中发挥重要的作用。

平滑肌细胞应VWF呈阴性，而a-肌动蛋白呈阳性。检测这一成份可了解培养物的纯度。

血管发生——从现有脉管系统形成新血管的过程——同时涵盖于正常生理与病理进程之中。这一过程对于肿瘤生长和转移扩散是必需的，因此它也是肿瘤学的一个研究热点。这一复杂的进程由多种信号通路所介导。

在血管发生过程中，内皮细胞会侵入周围的基底膜，向血管原性刺激来源迁移，增殖成为新的血管，并重新组建必要的三维血管结构。研究者们广泛应用体外分析的方法，于血管发生剂或抗血管发生剂存在的条件下来研究这些功能。

一旦收货，应依照产品说明书，即刻于4°C条件下对悬浮状态的新鲜肝细胞进行离心。以铺板形式提供的肝细胞应快速从盒中取出，并使用新鲜的培养基替换运输用培养基。在运输过程中使用的保存培养基主要用于保持低温；如果细胞温度高于8°C，运输培养基即出现对肝细胞的毒性。我们推荐您在开始实验前，先让种植细胞培养过夜以适应条件。

是的，您可订购William培养基E（货号A12176-01）和原代肝细胞维持添加剂（货号CM4000）。您可同时订购和运输肝细胞与培养基。

用户可使用Geltrex™基质覆膜在体外建立更为立体，类似肝脏的结构模型，延长健康肝细胞的培养寿命，从而便于进行诱导或肝胆运输等更长期的应用。一般推荐在分离操作后超过48小时的时间点应用Geltrex™基质覆膜。不推荐在转染肝细胞之前，或在蛋白分泌研究中使用Geltrex™基质覆膜。

不可以。覆膜将会干扰转染过程。对于转染分析而言，我们推荐您首先进行转染操作，之后再为细胞覆膜。

冻存的肝细胞被保存于干式液氮（LN2）气相运输器或杜瓦瓶的无害容器中，通过气相液氮进行运输。杜瓦瓶的内部温度维持在–140°C与–160°C之间，不开启的条件下通常能够保持此温度范围长达7-10天时间。肝细胞一经收到就应移至实验室内长期的LN2罐中，之后将杜瓦瓶归还至预付返货标签上列出的地址以供重复使用。

一旦收到冻存肝细胞，请小心迅速地将冻存管移至气相液氮中，并保持在–135°C以下的温度中直至使用。在开展实验前，冻存管发生任何温度上升都可能会危及肝细胞的活力、功能与细胞活性。

如经适当保存，冻存的肝细胞可在气相液氮（–135°C或更低温度）中保存数年之久。这对于开展长达数月的系列实验是十分理想的选择。

不同于永生化的细胞系，肝细胞是不能无限期培养的原代细胞。复苏后的悬浮肝细胞仅限于最多4-6小时孵育的短期实验。种板于胶原包被塑料器皿的培养基中的可贴壁肝细胞通常能维持2-7天的代谢活性，实际情况视具体应用而定。

我们推荐Gibco™ HepExtend™添加剂的冻融次数不要超过两次。因此，我们推荐化冻Gibco™ HepExtend™添加剂后即分装为一次性使用的单管，再保存于–20°C至–5°C的非除霜型冰箱中。

Gibco™ HepExtend™添加剂不含生长因子、细胞因子、FBS或药物小分子。不过，其中含有少量的BSA（50X，0.12375g/mL）。

Gibco™ HepExtend™添加剂能够兼容目前的肝细胞培养方法及相关设备，因此我们推荐您按照网站上所提供的Gibco™冻存和培养冻存肝细胞实验方案来开展实验。

我们推荐使用Gibco™ HepExtend™添加剂保持肝细胞的培养时间可长达10天，而且经测试对80%左右的人体批次均有效——其中包括代谢-合格，诱导-合格和转运体-合格的批次。

到目前为止，Gibco™ HepExtend™添加剂仅在冻存的人体肝细胞上进行过测试；因此我们不推荐将此添加剂用于其他物种。

Gibco™ HepExtend™培养基试剂盒包含了Gibco™ HepExtend™添加剂（货号A2737501）和Williams E培养基，500mL（货号A1217601）和肝细胞维持添加剂包（货号CM4000），其包含了配制肝细胞完全培养基所需的所有成份。