原代细胞培养支持 — 问题排查

原代细胞未经永生化处理，因此群体倍增次数有限。每一种细胞类型都拥有不同的最大群体倍增次数，这一参数可在产品指定批次的COA（certificate of analysis）上找到。如需了解“群体倍增”与“传代次数”两个术语之间的比较信息，请参考“入门”页面。

如果您正在使用不含动物源性成份（AOF）的添加剂来培养细胞，请确保使用了包被基质试剂盒。AOF添加剂中不含粘附因子，而包被基质试剂盒能够为细胞提供所需的粘附能力。

可以，由于原代细胞往往是非常敏感的，因此我们强烈建议您在LifeScience-CNTS@thermofisher.com联系我们的分子生物学专家，他们将帮助您选择最合适的转染试剂。

收货后立即将细胞保存于气相液氮中很重要。这些冻存管并不能确保不发生渗漏，将它们浸入液氮的液相中可能会使液氮渗入管中，进而影响细胞活力。

这些是衰老细胞，它们在成体角质形成细胞培养物中很常见。通常情况下培养物中会有一群衰老而不再增殖的细胞。而年轻细胞的个体更小，仍能够继续分裂。当培养物逐渐衰老，您就会观察到越来越多的大细胞，培养物最终也将停止生长。在正确培养和维持的情况下，这些培养物至少能够完成25次的群体倍增生长。

在接种细胞之前，请务必进行一下细胞活力计数，并按照推荐的接种密度进行接种。一些实验方案中提及的培养瓶数量是一个参考指标，您可据此估计每一管冻存细胞大致需要多少个培养容器。管子上的细胞数量是最低保证，，但一般都会多提供一些以确保您能收到我们承诺的细胞数量。也就是说，细胞计数对于保障准确的接种密度是至关重要的，这样您也就可以有效监控细胞生长的群体倍增次数了。

请参见下列原因和相关建议：

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这一问题可能由两种原因所导致：

• 最可能的原因是由于移除包被试剂和加入细胞之间的间隔时间过长，导致96孔板上包被的基质变干。包被基质一旦变干，就丧失了对细胞的粘附能力。我们推荐用户缩短移除包被试剂与加入细胞之间的间隔时间，最好每次只同时处理几个培养孔。
• 另外，在96孔板中分种细胞耗时较长，管中剩余的细胞可能会聚团。我们推荐您在分种之前再对细胞进行重悬。

这些细胞非常娇弱。我们建议您依照说明书中的操作步骤，并使用合适的培养基。快速化冻是健康培养的关键。这有一些需要考虑的关键项：

• 在使用前，所有的实验材料都使用培养基预先润洗。请勿使用PBS，DPBS或HBSS进行润洗，因为它们不含蛋白。
• 迅速化冻细胞，不要将细胞暴露于空气中。
• 首先将细胞移至预先润洗过的管中，之后缓慢地逐滴加入培养基。不要向细胞一次性加入全量的培养基，这一操作可能引起渗透压休克导致细胞活力降低。
• 使用预热的完全生长培养基，并以正确的细胞密度进行接种。
• 对于某些细胞培养而言，包被基质是必需的。
• 请勿离心原代神经细胞，它们在冻存后的恢复期极为脆弱。

神经干细胞诱导失败有几种可能的诱因：

• 高品质的hPSC细胞对于成功完成神经诱导至关重要。在神经诱导前去除已分化和部分分化的hPSC细胞。
• 在接种用于诱导的hPSC细胞之前，我们推荐用户对细胞进行计数，因为过低或过高的细胞汇合度都将降低诱导效率。诱导实验的推荐接种密度为2–2.5 x 10E4 cells/cm²。
• 应接种细胞团——而非单一细胞悬液——来进行诱导。
• 为了增加诱导效率，可在hPSC分裂期使用10 µM ROCK抑制剂Y27632进行过夜处理，以防止细胞过多死亡。

• 请检查是否在培养细胞的过程中使用了正确的B-27™ 添加剂。
• 通过检查B-27™ 添加剂的有效期来了解该产品是否过期。
• 检查所用含B-27™ 添加剂的培养基是否为新鲜配制。在4°C保存条件下，含添加剂的培养基仅在两周内保持稳定。
• 检查B-27™ 添加剂是否暴露在过热的条件下。化冻后的B-27™ 添加剂不可暴露于室温或更高温度条件下超过30分钟。
• 检查B-27™ 添加剂是否被反复冻融多次。化冻后的B-27™ 添加剂可在4°C条件下放置1周。
• 检查B-27™ 添加剂的外观。本品应为透明的黄色液体。绿色外观意味着添加剂已变质。