基因合成和突变支持 – 问题排查

使用CorrectASE™酶过度酶切可能会导致DNA模板降解。

确保反应不超过60分钟。同时，确保在PCR步骤前反应物保持冰浴，否则反应物将有可能被CorrectASE™酶过度酶切。

根据实验方案，寡核苷酸储存液应该用1X TE缓冲液配制，其终浓度为100 μM。下一行建议将浓度为10 μM的引物各取5μl加到一起。根据研发同事的反馈，操作手册这样写是因为他们通常将冻干的寡核苷酸配制成浓度为100 μM的储液（由于EP管体积的原因）。但是你做实验时可能会需要用到浓度为0.15 μM的引物pool。这时，你可以将储液稀释到10 μM或者将引物pool按1:10稀释。

请参考以下建议：

• 您使用的是什么聚合酶？对于两种突变试剂盒，我们都推荐使用AccuPrime™ Pfx DNA聚合酶——使用1个单位的聚合酶进行扩增。
• 尝试优化退火温度及延伸时间。按经验法则，采用的退火温度一般是比引物的最低Tm值低5至10摄氏度，延伸时间按照每30秒延伸1kb来计算。您可以尝试不同的温度/时间优化您的反应。
• 引物设计不合适会造成没有反应产物。我们推荐使用我们的工具降低可能的二级结构或增加引物长度。
• 检查您使用的起始DNA样本质量。
• 确保您在PCR反应中加入了足够量的DNA。

下面列举了引起这个问题的典型原因及解决方法：

• DNA量太少：每50 μL反应最多可以加入50 ng DNA。
• DNA质量差：重新纯化质粒。
• 使用了不合适的DNA聚合酶：我们推荐使用1个单位的AccuPrime™ Pfx DNA聚合酶进行扩增。
• PCR条件不合适：优化退火温度及延伸时间。
• 引物设计不合适：使用GeneArt引物与载体设计工具降低可能的二级结构或增加引物长度

下面是引起此问题的一些典型原因及解决方法：

• DNA甲基化酶失活或SAM失活：利用甲基化对照反应测试DNA甲基化酶及25X SAM的活性。
• 使用了太多的DNA：每50 μL甲基化反应体系中DNA的量不要超过50 ng。
• 过度扩增：将小质粒的PCR循环数降到12，或将中等长度的质粒的循环数降到15。