基因合成和突变支持 - 入门

GeneArt Strings™ DNA片段是客户定制的、未克隆的双链线性DNA片段，它们的长度在100到3000 碱基对（bp）之间，是使用与GeneArt高质量基因合成相同的工艺从合成的寡核苷酸组装而来。GeneArt Strings™ DNA片段可以用来快速克隆您的目的基因。在5（小于1000bp片段而言）到8（1000至3000 bp片段）个工作日内，可提供200 ng以上的GeneArt Strings™ DNA片段。GeneArt Strings™ DNA片段可在线进行设计、序列优化以及订购，是您克隆构建表达质粒的一种经济、明智的替代方法。

不是，GeneArt Strings™ DNA片段仅能合成100至3000 bp范围内的片段。如果您的序列长度超过3000 bp，则需要订购基因合成服务或通过2个或更多个GeneArt Strings™ DNA片段组装您的基因。另外，GeneArt Strings™ DNA片段流水线生产，可以快速、经济地为您提供基因产品。如果您的序列比较复杂，可能会收到一条信息，告诉您Strings™ DNA片段由于序列的高度复杂性而不能生产。在这种情况下，我们建议修改您的序列以满足生产标准（后文给出）或使用基因合成服务合成您的基因。在很多情况下，使用门户网站功能优化您的序列即可满足GeneArt Strings™片段的生产要求。如果仍然不能生产，您可以手动编辑序列以满足生产要求。

重要的生产标准有：

• GC含量20至80%（仅指峰值GC含量，而非总含量）
• 没有长的二级结构或重复序列
• 没有>25 bp的A/T延伸结构，也没有>20 bp的G/C延伸结构

GeneArt Strings™ DNA片段是寡核苷酸组装后进行的PCR扩增子，可直接用于筛选正确克隆。作为质量控制（QC）过程的一部分，我们对Strings™片段进行整体序列控制（bulk sequence-controlled）以确保您需要的序列包含在片段库中。

To identify a correct clone >为了使正确克隆的获得率>90%，我们建议您使用以下这些筛选指南：

• 小于1 kb的Strings™片段：测序2-4个全长克隆
• 1-2 kb的Strings™片段：测序3-5个全长克隆
• 2-3 kb的Strings™片段：测序4-8个全长克隆

不提供，GeneArt Strings™ DNA 片段不提供亚克隆或组装服务，因为其服务设计理念是为您提供获得基因的最快、最经济的方式。如果您不想自己克隆基因，我们建议您订购全基因合成服务。

1. 首先输入您的基因序列，在您的目的基因两侧加入attB1和attB2位点。
   
   
   
2. 保存并关闭。添加“Subcloning（亚克隆）”到您的基因合成项目。
   
   
   
3. 亚克隆到pDONR221或pDONR/Zeo。翻至页面末尾并勾选“Add service（添加服务）”下的“Subcloning（亚克隆）”。
   
   
   
4. 保存并关闭。您的进程将如下图所示：
   
   
   
5. 选择您想把目的基因移入的pDEST载体，然后保存并关闭。

1. 点击“Optimize Sequence（优化序列）”选项卡，然后选择“Protect Restriction Sites（保护限制性酶切位点）”或“Protect Sequence Parts（保护序列部分）”。
   
   
   
2. 选择您想保护的位点，或者输入您想保护的核苷酸序列。被保护的位点将显示在屏幕底部。点击“Optimization（优化）”选项卡，然后选择“Optimize（开始优化）”。
   

1. 创建一个基因合成项目。
2. 点击“Proceed to Summary（前进至总结）”选项卡。
   
   
   
3. 选择“Delivery Speed（送货速度）”，然后“Add to Cart（加入购物车）”。（请注意，如果“Add to Cart（加入购物车）”是灰色的并且只有“Send for Review（送至审阅）”是活跃状态，该项目必须被科学家审阅。点击“Send for Review（送至审阅）”，则您的项目将被分析。）
   
   
   
4. 您的项目的价格，以及估计的送货时间将显示出来。

一个项目可以有多个流程，但是可以作为一个项目而订购。以这种方式订购的话则运输/操作费用将仅产生一次。

GeneArt Strings™ DNA片段是未克隆的双链DNA片段，长度最长3,000 bp。GeneArt基因合成的产品是已经被克隆在标准GeneArt载体(pMx)内的双链DNA片段。请注意，一段序列可能因为重复序列或高GC含量而不能作为Strings™ DNA片段进行合成。在这种情况下，我们的科学家建议您通过基因合成订购您的基因。在某些情况下，您可以尝试使用GeneOptimizer算法优化您的序列，有时也是能得以成功优化并作为DNA片段进行订购。

基因通常被克隆进pMx标准载体。这些载体包含：

• 一个多克隆位点
• 一个复制起始位点（colE1）
• 一个抗生素抗性标记（氨苄青霉素，卡那霉素，链霉素，氯霉素）；请注意标准订单不保证任何特定的标准载体。

请注意标准订单不保证任何特定的标准载体。

GeneArt标准载体(pMx)无相关酶切位点的限制性内切酶列表

GeneArt标准载体(pMx)图谱

在我们的标准载体构建过程中不能随意选择酶切位点进行克隆。在我们的生产过程中，内切酶的引入通常会切去标准载体上的大部分多克隆位点。多克隆位点中包含更多酶切位点的原因是为了允许在某些情况下由于插入序列内部的内切酶位点而需要选择其他酶切位点的情况。

没有，并且无法定制。您需要自行亚克隆到您选择的载体。作为定制服务的“Geneart载体”部分，您唯一可选的是抗性标记（需要支付小额标记费）。

除您选择的内切酶位点之外，GeneArt合成过程中添加了标准内切酶位点，用于自动化克隆到GeneArt标准载体上。

是的，我们为每个GeneArt合成产品保留一份样本。

理论上，没有限制。但是，非常长的DNA片段（超过10 kb）需要克隆进一个低拷贝载体以确保遗传稳定性。因此，长度的提高意味着生产时间的延长。

请提供5-10µg载体DNA用于您的GeneArt用户定制服务。我们建议将DNA溶解在TE缓冲液或水中，或者作为沉淀固体运送。

对于合成有不同的监管/规则需要遵循，包括使用不同的实验室。在生物安全二级实验室，合成基因需要花费更长时间，因此这类项目费用更高。请注意，无论您如何选择，Thermo Fisher Scientific™公司和/或其附属机构都将进行生物安全评估。当您的选择为生物安全1级而我们的评估要求DNA在生物安全2级实验室合成时，您将收到一份根据生物安全2级要求修改的报价单供您审阅。

TSE代表Transmissible Spongiform Encephalopathy（传染性海绵状脑病），意味着无TSE标准的质粒制备所用的培养基是基于大豆的。

您通常会随订单收到下列内容：载体图谱，比对图谱，测序足迹图。扩展文件可能包括：

1. 数据存储证明——保证存储所有生产指标数据
2. 材料文件——包括所有使用过的化学物质的信息，包括供货商和货号
3. GLP源文件——包括所有使用过的试剂按批号信息记录的材料颗粒度文件

您可以下载您的FASTA格式的优化序列。它可以作为txt文件/格式读取。FASTA文件将给出对于基因的简单描述，然后给出一个非注释版本的序列。您可以使用免费在线工具将该文件和原始序列进行比对，或者如果您有Vector NTI软件的话，您可以使用它进行比对。

当预估的完成日期到达时，如果并不是所有的基因均合成完毕，则我们会送出部分订单。未完成的订单会分次按周发送。分批运送不会收取额外费用。

通常，我们会在预估最长完成时间的基因合成完毕后立即投递。在极少数情况下，订单在预估完成时间内没有全部发送。请注意，如果客户将基因合成和亚克隆作为一个过程订购，他们可能最先收到连到Geneart 载体上的目的基因的克隆，然后收到克隆到客户提供的亚克隆载体上的重组质粒。

不需要，您的载体已经被入库并测序，并且在它们被订购/使用一次之后便会出现在您自己的“我的门户载体”列表中。

有的，所有pMx载体包含一个M13 – 20引物结合位点和一个M13-R引物结合位点。其序列如下：

• M13 – 20引物结合位点：5'-TTGTAAAACGACGGCCAG-3'
• M13-R引物结合位点：5'-GGAAACAGCTATGACCAT-3'

单一突变和突变簇（超过一个突变的过程）是针对一个母体基因的突变。突变的标准如下：

突变可以包括下列改变中的1到4个：

• 5'/3'末端删除任意长度序列并在两侧各加入52 nt新序列
• 5'/3'两侧各修改最多52 nt序列
• 5'/3'两侧各延伸最多52 nt序列
• 内部修改最多40 nt序列（最多允许3个内部修改单元）
• 删除内部任意长度序列

注意：不同修改（无论是内部还是5´/3´）之间必须间隔至少100 bp。

如果一个基因的改变超出了这些标准，那么它必须作为一个单独的基因合成而不能作为一个突变来完成。

可以。将“single variant”作为新过程添加，然后选择“upstream service”（“gene synthesis”，“already at Geneart”，或者“I will provide this master gene”）。如果您提供的是您自己的基因，那么您将需要填写载体+插入片段的全部序列。如果它只是一个质粒，您将需要将突变区域填写为“insert”，而将质粒剩余部分作为“vector”。“插入片段”最长可以是4 kb。

请查看以下链接探索我们的合成生物学服务，其内容包含：载体构建，cDNA文库构建，蛋白表达服务，定向进化服务，质粒服务，以及细胞系和蛋白服务。

TALs是类转录因子的效应蛋白，是天然的转录激活因子。GeneArt Precision TALs允许研究者选择它们想要功能化的精确DNA序列，并且据此构建特定的TAL基因以实现此目的。

两种试剂盒几乎相同，但是PLUS试剂盒包含一个改进的2X GeneArt酶混合物，并提供了针对多点突变优化的protocol （最多3个位点，所用质粒最大14 kb）。PLUS试剂盒还可以用于在小于14 kb的质粒内进行最多25个核苷酸的单点突变，而原来的试剂盒只能用于最多12个核苷酸的替换/删除/插入。有一个网络工具可以用于引物设计，该工具也适用于原来的试剂盒。

• GeneArt试剂盒合并了甲基化和DNA扩增步骤，实验方案节省了1小时
• GeneArt 无缝克隆和组装试剂盒内的酶混合物是实验方案的一部分，可以大大提高了克隆的效率而无需进行很多轮PCR扩增（这是另一个节省时间的步骤）
• 新试剂盒还包含一个应用于PCR步骤的增强子，可以提升突变效率，适用的质粒大小范围很广。

GeneArt定点突变试剂盒内的DNA甲基化酶不作为单独产品出售。

浓度是32 mM。

引物长度在30-45 nt左右，突变位置应位于引物中央。根据突变的大小，突变两侧应至少有15-20 nt的侧翼序列，引物的长度不超过45 nt。我们建议使用我们的在线GeneArt引物设计工具。

当在环形模板上进行第一个PCR循环时，聚合酶将生成两个能够退火并在下一个循环能进行引物延伸的线性产物（参见下图）。在两个末端引入了突变的PCR产物将在后续循环中累积。在PCR之后，PCR产物经过重组反应进行环化，从而进一步提高了突变效率。

通常而言，退火温度应该在55-64摄氏度，这也是AccuPrime™ Pfx聚合酶的PCR反应的推荐温度。引物的Tm温度将比退火温度高约5度。例如，随试剂盒提供的正链对照引物其退火温度是65摄氏度（最近相邻法）。

对于高GC含量序列我们建议减小引物长度，因为很高的Tm温度可能导致非特异性条带。之前有一个客户报告说使用Tm温度大约为80摄氏度的21-nt 引物获得了成功。

聚合酶对于阅读富含AT的区域是没有问题的。只有高GC含量区域对于聚合酶而言较为困难，因为其Tm较高。

GeneTailor™试剂盒（已停产）的引物设计指南将仍然工作，只要引物含有互相重叠的15-20个核苷酸的区域。但是，为了使引物设计更加直接，我们只建议用户转到使用GeneArt指南。

这种情况最可能的原因是在PCR过程中由于引物形成发夹结构而产生了重排。您可以尝试提高PCR步骤的退火温度以减少二级结构形成。筛选更多的克隆也会有帮助。

通常而言，PCR增强子提高PCR产物的产量。它对于DNA甲基化没有任何作用。该10X增强子是针对Accuprime™ Pfx优化的，它对于其它聚合酶可能不起作用。如果您需要优化PCR条件（对于退火温度，延伸时间等），您可以使用AccuPrime™ Pfx酶进行标准体系优化，不需要加入增强子。

目前的试剂盒内没有提供DNA聚合酶。我们确实建议您在使用该试剂盒进行定点突变实验时购买AccuPrime™ Pfx DNA聚合酶，因为我们使用该聚合酶对反应条件和实验方案进行了优化。

This is most likely due to rearrangement caused by hairpin formation of the primer during PCR. You can try and increase the annealing temperature of the PCR step to relax secondary structure formation. Screening more colonies should also help.

For GeneArt™ mutagenesis services, we will need the DNA or amino acid sequence of the gene you would like to mutagenize, the host organism you plan to use (this is important for gene optimization if you choose to include it with your request), the restriction sites you need at the 5’/3’ ends and/or to avoid internally, and whether or not you want any other added motifs (e.g., Kozak sequence, stop codons, etc.).

Variants may contain up to four of the following modifications:

• 5'/3' deletion of any length with additional 52 nt of new sequence on each side
• 5'/3' modification of maximum 52 nt on each side
• 5'/3' extension of maximum 52 nt on each side
• 5'/3' extension of maximum 52 nt on each side
• Internal modifications of up to 40 nt (a maximum of 3 of these internal modification blocks are allowed)
• Internal deletions of any length