Gateway重组和Seamless克隆支持 – 问题排查

• 延长孵育时间至最长18小时。
• 确保转化前使用蛋白酶K处理反应产物。
• 检查是否使用了正确的抗生素进行筛选。
• 检查att位点序列是否正确。
• 检查是否使用了正确的Clonase酶以及它是否功能正常。
• 检查是否在反应中使用了推荐量的DNA。
• 检查引物设计并试一试使用凝胶/PEG纯化attB-PCR产物。
• 如果attB-PCR产物或线性attB表达克隆太大（>10 kb），请将BP反应物孵育过夜。

• 延长孵育时间至最长18小时。
• 确保转化前使用蛋白酶K处理反应产物。
• 检查是否使用了正确的抗生素进行筛选。
• 检查att位点序列是否正确。
• 检查是否使用了正确的Clonase酶以及它是否功能正常。
• 检查是否在反应中使用了推荐量的DNA。
• 使用pENTR-Gus质粒进行阳性对照重组。
• 如果入门克隆或目标载体太大（>10 kb），那么请将LR反应物孵育过夜，线性处理目标载体或入门克隆，或使用拓扑异构酶I解旋目标载体。

• 使用pUC19进行转化以检查感受态细胞是否正常。
• 提高铺板使用的菌量。

• 使用pUC19进行转化以检查感受态细胞是否正常。
• 提高铺板使用的菌量。

• 质粒由于太大或有毒性而在培养过程中丢失（您可以试一试在30摄氏度下孵育；使用Stbl2 E. coli 以稳定质粒)。
• ccdB基因发生缺失（部分或全部）或点突变（请使用新的pDONR载体）。

• 质粒由于太大或有毒性而在培养过程中丢失（您可以试一试在30摄氏度下孵育；使用Stbl2 E. coli 以稳定质粒)。
• ccdB基因发生缺失（部分或全部）或点突变（请使用新的目的载体）。
• 小克隆可能是与表达克隆共转化的未反应的入门克隆（请降低入门克隆的使用量至每10 µL 反应50 ng；降低用于转化的样本量至1 µL；对于带氨苄抗性标记的目的载体，提高氨苄浓度至300 µg/mL)。

检查反应产物是否被转化进了包含F'episome和ccdA基因的 E. coli 菌株中（请使用不包含F'episome的 E. coli 菌株，例如OmniMAX™ 2-T1R, TOP10）。

• 检查ccdB基因是否有缺失（全部或部分）（在含有50-100 mg/mL氨苄和15-30 µg/mL氯霉素的培液中扩增）。
• 检查是否有其它抗性菌株污染。
• 检查反应中是否使用了合适用量的DNA。

如果插入片段对宿主细胞可能有毒，以下为解决该问题的建议：

• 转化之后在25至30摄氏度下而不是在37摄氏度下孵育。这样做会降低菌株的生长速度并提高克隆毒性插入片段的成功率。
• 试试使用Stbl2细胞进行转化。

以下为可能的原因及相应的处理建议：

• 引物设计错误：确保正向PCR引物5′末端含有序列CACC。CACC这四个核苷酸和Directional TOPO载体上突起的序列GTGG互补配对。
• 反向PCR引物与5′末端的GTGG突起互补：确保反向PCR引物5′末端不含有CACC序列。
• 正确克隆的插入片段可能对宿主细胞有毒性，导致克隆到的全部是反向插入片段。转化之后在25至30摄氏度而不是在37摄氏度下孵育。这样做会降低菌株的生长速度并提高克隆毒性插入片段的成功率。
• 试试使用Stbl2细胞进行转化。

检查反应产物是否被转化进了包含F’episome和ccdA基因的E. coli菌株中（请使用不包含F’ episome的E. coli菌株，例如OmniMAX™ 2-T1R, TOP10）。

• 检查ccdB基因是否有缺失（全部或部分）（在含有50-100 mg/mL氨苄和15-30 µg/mL氯霉素的培液中扩增）。
• 检查是否有其它抗性菌株污染。
• 检查反应中是否使用了合适用量的DNA。

• 延长孵育时间至最长18小时。
• 检查是否使用了正确的抗生素进行筛选。
• 检查带attB位点的PCR产物和pDONR载体组合是否正确。
• 检查是否使用了正确的Clonase酶以及它是否功能正常（进行BP反应阳性对照）。
• 检查是否在反应中使用了推荐量的DNA。
• 如果attB-PCR产物或线性attB表达克隆太大（>5 kb），那么请将BP反应孵育过夜。

• 检查是否使用了正确的Clonase酶以及它是否功能正常（请确保使用LR Clonase II Plus酶）。
• 检查是否使用了正确的入门载体和目标载体组合。
• 确保使用了正确的入门克隆（以及它们测序正确）。
• 检查在反应中是否使用了推荐用量的入门载体和目标载体。
• 进行LR反应阳性对照以确定入门克隆是否有问题（请注意：MultiSite GW 3片段试剂盒仅提供单一对照载体pMS/GW，它可用于生成所有对照pENTR载体）。
• 检查是否使用了正确的抗生素进行筛选。
• 检查目标载体内的att位点序列是否正确。
• 延长孵育时间至最长18小时。

• 使用pUC19进行转化以检查感受态细胞是否正常。
• 提高铺板使用的菌量。

• 质粒可能由于太大或有毒性而在培养过程中丢失（您可以试一试在30摄氏度孵育；使用Stbl2 E. coli以稳定质粒）。
• 这可能是由于ccdB基因发生缺失（部分或全部）或点突变（这种情况请使用新的pDONR载体或目标载体）。
• LR反应：小克隆可能是与表达克隆共转化的未反应的入门克隆（请降低入门克隆的使用量至每10 µL反应50 ng；降低用于转化的样本量至1 µL；对于带氨苄抗性标记的目标载体，提高氨苄浓度至300 µg/mL）。

• 检查反应产物是否被转化进了包含F'episome和ccdA基因的 E. coli 菌株中（请使用不包含F'episome的 E. coli 菌株，例如OmniMAX™ 2-T1R, TOP10）。
• 这可能是由于ccdB基因有缺失（全部或部分）造成的（在含有50-100 mg/mL氨苄和15-30 µg/mL氯霉素的培液中扩增）。
• 这可能是因为有其它抗性菌株污染。
• 检查反应中是否使用了合适用量的DNA。

很不幸，GeneArt 克隆和组装试剂盒里的10X酶混合物在-20摄氏度下不稳定，并会在此温度下迅速失去活性。酶混合物在-20摄氏度保存两个月后其产出的克隆数量会大大下降。

请参考下面的建议：

• 检查PCR产物的纯度。
• 确保片段末端之间存在所需的末端同源序列。
• DNA末端可能在制备过程中被破坏了（例如暴露于UV照射），请减少DNA暴露于UV/EtBr的时间。
• 检查DNA插入片段和载体之间的比例（插入片段：载体摩尔比2:1）。
• 确保正确操作GeneArt 酶混合物。该酶是温度敏感的。请在使用后立刻放回存储位置。不要将其放在室温或冰上过长时间。

检查以确保克隆载体的线性化是完全的。另外，GeneArt酶混合物加入的顺序对实验很关键 - 请最后加入酶混合物。最后，检查反应的孵育时间是否是推荐的时间。

使用凝胶电泳检查您的PCR产物。您可能得到了多个PCR产物，导致在您的载体中连入了错误的插入片段。对PCR产物进行凝胶纯化能帮助解决这一问题。

请参考以下建议：

• 完全按照实验步骤要求进行转化。
• 不要冻融或漩涡混匀MaV203酵母感受态细胞。
• 使用CSM-Trp琼脂平板进行转化。
• 要获得最佳结果，请使用新开瓶的DMSO。您也可以使用保存在-20摄氏度下的DMSO。

请参考以下建议：

• 确保DNA片段带有所需的同源末端并且用量合适。
• 如果使用的是Stitching寡核苷酸，您必须同时使用正义链和反义链（您无需对它们进行退火）。
• 使用PCR纯化试剂盒对片段进行纯化。如果使用的是凝胶纯化的DNA，请特别注意避免DNA被损伤，尽可能减小暴露于UV照射的时间并使用低功率UV光源。
• 确保您的载体带有在酵母中扩增所需的合适遗传元件。否则，我们建议您使用GeneArt High-Order载体转换元件。

确保您的酵母转化在30摄氏度下孵育3天，以获得合适大小的克隆。

我们建议将克隆重新接种到新的平板上并再次进行菌落PCR。不要使用试剂盒提供的微珠破坏酵母细胞，那些微珠是用于进行E. coli 转化的。另外，在50 uL PCR反应中使用不超过0.5微升稀释后的酵母裂解物。

以下是一些可能的原因和解决方案：

• 低转化效率：严格按照用户手册中的说明进行转化实验。
• 感受态E. coli 操作不正确：感受态E. coli很脆弱。请轻柔地操作这些感受态E. coli，轻柔地使用移液器将其重悬。不要对感受态E. coli 进行漩涡混匀。不要冻融感受态E. coli。感受态E. coli仅能被冻融一次，否则其感受能力将极大受损。将感受态E. coli存储在-80摄氏度。
• 铺板使用的E. coli量不足。提高铺板所用的E. coli量。
• • 转化子铺在了含有错误抗生素的平板上：使用正确的抗生素进行筛选。对于pType IIs受体载体，请使用50–100 μg/mL氨苄青霉素。

以下是一些可能的原因和解决方案：

• PCR产物不够纯。重复PCR扩增并可用不同的方法进行纯化。或者，您可以对原始PCR产物进行酚:氯仿抽提，然后进行乙醇沉淀。
• DNA插入片段不包含Type IIs内切酶所需的识别序列：确保您的DNA插入片段和克隆载体含有GeneArtType IIs组装反应所需的识别序列（请参考用户手册第11页对于5′ DNA突出序列的要求，以及第14页对于PCR引物设计的要求。）或者，您可以使用GeneArt Primer and Construct Design 工具进行引物设计。
• PCR生成的DNA插入片段的末端损伤：请特别注意尽量减少对DNA插入片段末端的损伤，在将凝胶暴露于UV光照时请将凝胶放于胶盒内，使用低功率UV光源，并尽量减少凝胶暴露于UV光照的时间。请注意，在凝胶纯化后可能需要进行一次额外的异丙醇沉淀以获得最佳结果。
• DNA插入片段和/或载体使用量不正确：确保您使用了正确用量的DNA插入片段和/或载体进行克隆。要获得最佳结果，请使用GeneArt Primer and Construct Design 工具来确定每个DNA片段的使用量。
• 用来生成DNA片段的引物质量不好：确保使用高质量的引物，避免突变，因为在限制性酶切位点或末端突出序列上即使存在一个单一的突变也足以破坏整个多片段组装反应。
• DNA插入片段可能包含多个重复序列：多个重复序列可能会产生致死表型。

这说明GeneArt Type IIs酶混合物没有被正确操作。请参考以下建议：

• 在冰上快速融化GeneArt Type IIs酶混合物，并在使用后立即放回到-80摄氏度下。
• 不要对酶混合物进行超过6次冻融。
• 不要将酶混合物在室温或冰上放置过长时间。
• 反应混合物和酶混合物拿出来后要立即使用，不要在外面放太久。

我们建议使用新鲜制备、含有正确筛选抗生素的的LB平板。