Gateway重组和无缝克隆支持 - 入门

请查看使用Clonase II的Gateway技术手册第13页获取所需信息。

在得到attB-PCR产物之后，我们建议对产物进行纯化以去除PCR缓冲液，残留的dNTP，attB引物，以及attB引物二聚体。引物和引物二聚体在BP反应中会高效的与供体载体重组，因而会增加转化E. coli时的背景，而残留的PCR缓冲液可能会抑制BP反应。使用酚/氯仿抽提，加醋酸铵和乙醇或异丙醇沉淀的标准PCR产物纯化方案不适合对attB-PCR产物进行纯化，因为这些实验方案通常仅能去除小于100 bp的杂质，而在去除较大的引物二聚体时效果不佳。我们推荐一种PEG纯化方案（请参见使用Clonase II的Gateway技术手册第17页）。如果使用上述实验方案您的attB-PCR产物仍然不够纯，您可以进一步对其进行凝胶纯化。我们推荐使用Purelink Quick 凝胶纯化试剂盒。

理论上，pDONR载体在BP反应时对插入片段没有大小的限制。我们自己测试过的最大片段是12 kb。TOPO载体对插入片段大小更敏感一些，要获得较高的克隆效率其插入片段长度的上限是3-5 kb。

我们自己成功克隆进pDONR载体的最小插入片段是70bp，最大是12 kb。虽然成功克隆50-200 bp小片段和序列有一定的关系，但是有文献显示非常小的插入片段（约30 bp）不能被有效克隆（Cheo et al., Genome Research, 14:2111-2120）。

可以使用pDONR201和pDONR207，但是尽管pDONR201和pDONR207都含有pUC复制起始点，它们的复制效率却低于我们提供的pDONR221和pDONR/Zeo供体载体，这导致质粒的产量较低。使用pDONR221时，质粒的产量范围是每毫升菌液0.5 - 1.0 µg DNA。

pDONR221和pDONR/Zeo载体的骨架完全相同，除了抗生素抗性标记不同。pDONR221带有卡那霉素抗性标记，而pDONR/Zeo带有Zeocin抗性标记。

要实现最高效的BP反应，最好要使attB位点的摩尔数不要超过attP位点的。标准的BP反应（20 µL）使用300 ng (不超过500 ng)的pDONR载体和30-300 ng两侧带attB位点的PCR产物或表达克隆在25摄氏度孵育1小时。在反应中使用过多的供体载体将抑制BP反应并且会导致完整的供体载体和入门载体共转化。这将降低平板上的克隆数，因为ccdB基因的存在会杀死转化后的E. coli。将孵育时间延长至24小时可以将更大比例的起始attB-DNA转化为产物。对于> 4 kb的PCR产物，每fmol PCR DNA获得的克隆数随着片段大小的增加而下降。因此，对于较大的PCR产物，我们推荐将每20 µL反应的PCR产物用量提高到至少100 fmol，并使用超过1小时的孵育时间（例如6小时或孵育过夜到24小时）。我们自己克隆过的最大PCR片段是10.1 kb。将孵育时间延长至4-6小时通常会将克隆产出提高2-3倍，而孵育时间延长至16-24小时会将克隆产出延长5-10倍。

您可以继续，但重组效率将降低大约10倍。

所有供体载体和目标载体均含有ccdB细胞致死基因以降低非重组BP/LR质粒的背景。因此，扩增非重组质粒需要使用对ccdB致死作用具有抗性的特殊细胞（One Shot ccdB Survival 2 T1R感受态细胞）。另一方面，通用的E.coli克隆菌株，包括TOP10或DH5a，可以用于BP或LR反应转化，或用于扩增和维持重组后的Gateway重组子。

不行，因为LR Clonase中的Xis蛋白抑制BP反应。但是，您可以顺次进行这两个反应。

BP Clonase和LR Clonase分别带有5X BP反应缓冲液或5X LR反应缓冲液，包装于单独的试管中并需要保存于-80摄氏度。相反，BP Clonase II和LR Clonase II分别提供预混的BP Clonase/LR Clonase和5X BP/LR反应缓冲液。这些预混的溶液更加稳定，可以保存在-20摄氏度。

LR Clonase Plus已经停产并被LR Clonase II Plus替代。LR Clonase II Plus针对多位点Gateway重组反应进行了特别优化。LR ClonasePlus之前带有5X LR反应缓冲液，包装于单独的试管中并需要保存于-80摄氏度。LR Clonase II Plus提供预混于同一试管中的LR Clonase Plus和5X LR反应缓冲液。预混的溶液更加稳定，可以保存在-20摄氏度。多位点Gateway LR Clonase II Plus实现效率最高的多位点重组反应。您可以使用LR Clonase II Plus进行单片段重组，但是您不能使用标准的LR Clonase或LR Clonase II进行多位点重组反应。

不行，这并不可行，因为attL序列长度大约为100 bp，这对于高效合成寡核苷酸来说太长了，并且这将影响PCR反应。相反，attB序列仅有25 bp长，这是一个很合适的长度，可以将其加到基因特异性PCR引物的5'末端。

不能，因为N-末端标签的目的载体需要有一个终止子，而终止子的存在将阻断C-末端标签的表达。

attB和attL位点的核心区含有限制性内切酶BsrG1的识别序列。因此，我们推荐使用BsrG1从Gateway载体上切下插入片段并用以验证BP和LR反应是否成功。BsrG1的识别序列是TGTACA。只要插入片段内没有BsrGI位点，则该酶便可以用来从大多数Gateway质粒上切下整个插入基因。插入片段可以从除了pDONR P4/P1R之外的所有pENTR和pDONR载体上释放出来，pDONR P4/P1R是3片段多重Gateway系统的一部分，它含有一个与attL1和attL2序列不同的attL4位点。如果需要其它的限制性酶切位点，则需要使用PCR将适当的序列加入到插入片段中。

我们不提供任何植物目的载体，但是您可以使用Gateway载体转化试剂盒（货号11828-029）改造Gateway兼容的植物表达载体。作为一项客户定制服务，我们提供pDONR P3-P4和pDONR P5-P6载体。每种载体10 µg，并且两种载体必须同时订购。如果您对这一服务感兴趣，请发送e-mail到custom.services@lifetech.com

供体载体和入门载体含有两个转录终止序列（rrnB T1和T2），分别位于attP1或attL1或attR1上游。这可以避免载体上其他启动子转录克隆的目的基因，从而降低了可能的毒性效应。

pCR8/GW/TOPO入门载体使用壮观霉素抗性进行筛选，以便生成的入门克隆可以和任意目的载体配合使用。尽管少数几个目的载体带有卡那霉素抗性或Zeocin抗性，大多数目的载体都是带有氨苄抗性的。否则的话，如果不预先对入门载体线性化，背景将会过高。壮观霉素是一个较不常用的筛选标记。我们不提供壮观霉素；盐酸壮观霉素Sigma有售，货号S4014。

不会，如果配合合适的哺乳动物DEST载体使用，则Shine-Dalgarno序列不会对基因在哺乳动物细胞内表达产生负面影响。

A, B,以及C读码框元件之间各相差一个核苷酸，以便配合在所有3个读码框内都能生成attR位点。每个读码框元件都包含一个独特的限制性酶切位点，以便您对它们进行区分（请参见用户手册第3页的表格）。

以下是一些需要检查的事项：

1. Att位点必须被正确的标记为Miscellaneous Recombination特征类型（attR1或attR2也是一样）；
2. ccdB CDS必须在载体上被注释（为“ccdB”），并且
3. 载体必须是环状的。

如果该质粒仍然没有被识别为Gateway克隆，则请将其att位点的序列和一个与其类似但被识别为Gateway载体的att位点序列进行比较。如果有一些点突变，则请根据被识别载体上的序列编辑不被识别的载体上的att序列。然后继续在Vector NTI程序内进行Gateway克隆。

上述单核苷酸差异在所有att位点内都是非关键核苷酸，但是旧版的Vector NTI程序对识别Gateway克隆载体有严格的要求。

目的基因必须两端带有合适的att位点，或者是入门克隆中的attL (100 bp)位点，或者是PCR产物中的 attB (25 bp)位点。对于入门克隆而言，所有位于attL位点之间的部分都将被转移到含有attR位点的Gateway目的载体中，而两端带有attB位点的PCR产物需被转移到一个含有attP位点的供体载体，例如pDONR™221。

翻译起始位点的位置，终止子，或者用于表达的融合标签必须在最开始的克隆设计中考虑到。例如，如果您的目的载体包含一个N末端标记而非C末端标记，则该载体应当已经带有合适的翻译起始位点，但是终止子应当被包含在插入片段当中。

理论上没有片段大小限制。长度在100 bp到11 kb之间的PCR产物可以被直接克隆到pDONR™ Gateway载体中。其它DNA片段如带有att位点的150 kb DNA片段可以成功和一个Gateway兼容载体发生重组。对于大的插入片段，推荐进行过夜孵育反应。

我们提供 One Shot ccdB Survival™ 2 T1R细胞（货号A10460）用于扩增包含ccdB的质粒。

对照模板的序列是受专利保护的。

我们不提供任何用于在植物内表达的Gateway载体。

5X LR Clonase缓冲液或5X BP Clonase缓冲液不作为单独产品出售。它们作为酶试剂盒的一部分进行销售。

建议使用一个供体载体进行一次BP反应以获得一个入门克隆。然后将这一入门克隆和目的载体进行一次LR反应以获得新的表达克隆。

有的，我们能提供针对BP/LR Clonase反应的一步克隆实验方案DNA可以在一步反应后被克隆到目的载体中，从而节省了您的时间和金钱。

在BP/LR Clonase反应的一步法实验方案中，不建议用BP Clonase酶和LR Clonase酶替代BP Clonase II 酶/LR Clonase II酶，因为这样的重组效率非常低。

建议将其储存在4°C。

小抽（碱裂解）纯化的DNA即适用在Gateway克隆反应中。重要的一点是要将RNA污染去除干净以便得到精确的定量。推荐使用通过我们的S.N.A.P.™ 核酸纯化试剂盒，ChargeSwitch试剂盒，或PureLink试剂盒纯化的质粒DNA。

请注意，MultiSite Gateway Pro试剂盒 (2.0，3.0，及4.0)和MultiSite Gateway 3片段载体构建试剂盒已经于2015年12月31日停产。替代产品是MultiSite Gateway Pro Plus试剂盒（货号12537100），它可用于多达4个DNA片段的克隆。

使用MultiSite Gateway Pro Plus试剂盒，您可以使用任何带有attR1和attR2位点的目的载体，而MultiSite Gateway 3片段载体构建试剂盒包含一个带有特殊att位点的特殊目的载体。另一方面，MultiSite Gateway 3片段载体构建试剂盒的主要优点是您可以使用带有attL1和attL2位点的标准入门载体。两个试剂盒之间的酶是互相兼容的，而载体不能互相兼容。

提供，我们提供pcDNA6.2/V5-PL-DEST载体，它是没有启动子的。如果您想使用MultiSite Gateway Pro试剂盒克隆您自己的5’启动子，那么您可以使用该载体。

抱歉，我们不单独出售任何的MultiSite Gateway相关载体。对于MultiSite Gateway 3片段载体构建试剂盒（于2015年12月31日停产），pENTR 5′-TOPO载体可以用于生成包含5′元件的入门克隆（不需要和pDONRP4-P1R进行BP反应），而带有attL1和attL2位点的入门载体可以用于生成包含目的基因的入门克隆（不需要和pDONR221进行BP反应），但是包含3′元件的入门克隆仍然需要通过和试剂盒提供的pDONRP2R-P3载体进行BP反应来生成。但是，对于MultiSite Gateway Pro试剂盒（2.0, 3.0, 和4.0于015年12月31日停产，替代产品是MultiSite Gateway Pro Plus试剂盒，货号12537100），仍然需要使用试剂盒内提供的供体载体来生成所需的入门克隆。

标准的MultiSite Gateway反应是在25摄氏度孵育16-18小时。使用2 µL或4 µL（对于4片段重组）反应产物转化One Shot Mach1细胞。使用Mach1细胞替代TOP 10细胞以获得最高效率。对于2片段和3片段重组反应，重要的是保证最优的质粒摩尔比（20 fmole的 pDEST + 10 fmole的pENTR载体）。一般可以获得数以百计的氨苄抗性克隆，克隆效率达到90%（3片段重组反应的效率稍低，通常为70-90%）。对于2片段重组，可以用SOC培养基按1:10比例稀释转化产物，然后涂板50或100 ul。对于3片段重组反应，使用50或100 ul转化产物涂板。对于4片段重组反应，每10 fmole pENTR质粒对应20 fmole的pDEST 载体。孵育16小时并转化Mach1细胞。4片段重组的克隆数和转化效率通常会降低。根据克隆的插入片段不同，得到的正确克隆数量从80%到30%不等。

MultiSite Gateway Pro 2.0, 3.0, 和4.0试剂盒已于015年12月31日停产。替代产品是多位点Gateway Pro Plus试剂盒，货号12537100，可用于克隆多达4个DNA片段。

试剂盒内提供了pDONR 221作为BP重组反应的阳性对照，但是它不能用于生成多片段入门克隆。

对于LR反应，所有入门克隆都可以使用试剂盒内提供的对照入门克隆所替代。预期的克隆数和/或产生的克隆的表型可以被用来确定LR重组反应的效率。在极端情况下，如果目的载体attR位点不正确，那么LR反应将不会产生任何克隆。通过顺次进行载体替换反应，有问题的入门克隆可以被找出来。

• 对于2片段LR Clonase II Plus阳性对照反应，如果使用全部10 µL LR反应进行转化，预期的克隆数为2,000 – 15,000
• 对于3片段LR Clonase II Plus阳性对照反应，如果使用全部10 µL LR反应进行转化，预期的克隆数为1,000 – 5,000
• 对于4片段LR Clonase II Plus阳性对照反应，如果使用全部10 µL LR反应进行转化，预期的克隆数为50 – 500

GeneArt Seamless PLUS试剂盒是原来试剂盒的升级版。它被推荐用于4片段组装并且最大可组装40 kb的载体，而原来的试剂盒最大可组装的载体仅为13 kb。GeneArt酶混合物以带有缓冲液的2X混合物形式提供，可以存储于-20摄氏度而不是-80摄氏度。最后，试剂盒包括线性化的pYES7L载体和Stbl3/pRK2013感受态细胞，可以将载体横向转移到很多种受体菌株内。使用此处表格以选择最适合于您的应用的GeneArt Seamless克隆和组装试剂盒。

DH10B T1 SA被优化用于大片段组装克隆，并且我们不推荐使用其它感受态细胞代替。

我们建议GeneArt Seamless克隆至少要有15 bp的同源区域，对于较大的插入片段我们也尝试过40或80 bp。

理论上，GeneArt Seamless克隆系统可以用于文库构建，但是我们没有测试两种中任何一种应用。要进行文库构建需要生成带有克隆载体同源序列的接头。

我们推断短片段的效率可能会高一些。对于一个5 kb片段我们得到过100%的克隆效率，但是克隆数比2 kb片段少。例如，对于5 kb片段1 uL反应可获得大约400个克隆，而对于2 kb片段1 uL反应可获得大约1200-2000个克隆。另外，我们还观察到，在类似5 kb的大片段组装过程中，如果没有对该5 kb片段进行凝胶纯化并且有一个明显的较小PCR条带，那么较小的片段比5 kb片段更容易被克隆进载体。对于1 kb或2 kb的片段我们没有观察到类似现象。

我们不建议过度孵育，因为酶混合物会回切，导致缺失突变。较短的孵育时间（例如20分钟）可能是可行的。对于4个片段和1个载体，我们试过15摄氏度，室温，以及30摄氏度，而最佳结果是在室温获得，克隆效率达77%。另外两个温度的克隆效率分别是31%和37%。我们不建议在冰上孵育，因为这可能会导致在连接处产生很多缺失突变。

克隆数取决于很多因素，包括载体的制备方法、载体的末端（3’突出产生最多的克隆，5’突出产生克隆较少，而平末端产生的克隆数和3’突起相似）、转化效率、插入片段的大小，以及插入片段的新鲜程度。预期的克隆数范围如下：

单片段克隆（1+1）：每微升反应产生500-15,000 克隆
2片段克隆（1+2）：每微升反应产生500-10,000克隆
3片段克隆（1+3）：每微升反应产生200-2,000克隆
4片段克隆（1+4）：每微升反应产生50-2,000克隆

我们不建议这么做，因为克隆效率/克隆产出会降低。这里有一些增加大片段组装成功率的诀窍：

• 确保载体背景较低——酶切载体，胶回收，然后PCR扩增载体。如果不能进行PCR扩增，可以再进行一次纯化以避免凝胶纯化后对反应的抑制。
• 试试将载体和片段之比从1:2改为1:1。
• 转化时不要用超过6 µL的反应产物，并且不要用OmniMAX 2细胞，尽管它们的克隆效率较高。TOP10和MAX Efficiency DH5alpha感受态细胞转化效率最高。
• 在加入SOC后孵育更长时间（2小时）。使用950 µL SOC，37摄氏度孵育2小时，然后离心沉淀细胞。去除大约800µL，将剩下的部分进行涂板。
• 较长的重叠区域（例如80 nt）有利于大片段重组。如果片段的末端之间具有较长的重叠区域，那么孵育45分钟到1小时可能提高克隆效率。但是，较长的孵育时间对于小片段（300 bp）的重组则可能有负面影响——重组酶将过多回切片段的末端。

我们测试过的最小片段是100 bp（>95%的克隆含有插入片段）。我们没有试过使用退火后的寡核苷酸作为插入片段。

对于单独的片段大小没有限制，只要重组后4个单独片段加上载体的总长度不超过13 kb。

对于单独的片段大小没有限制，只要重组后4个单独片段加上载体的总长度不超过40 kb

这不会是一个问题。比推荐的长度少几个碱基的重叠区域仍然会在反应中正常发挥作用。但是，获得最佳结果的重叠区域是15 bp。

对大于60 kb的片段我们的建议是至少设计与相邻片段有50个核苷酸的重叠区域。对小于60 kb的片段，建议使用30个核苷酸的重叠区域。

我们开发试剂盒时使用的是脱盐的寡核苷酸，但是更高的纯度将稍微提高克隆效率，特别是在进行片段编辑时。

可以，试剂盒可以对最多5个片段和3个寡核苷酸补丁（Stitches）进行组装。

如果这些片段全部小于5 kb且分子的总长度小于13 kb，那么我们建议使用GeneArt Seamless克隆和组装（PLUS）试剂盒。如果您组装的片段没有末端同源性，或者由于太大而不能进行PCR扩增，或者组装后的分子大于13 kb，那么我们推荐使用GeneArt High-Order组装系统。总体来说，High-Order 系统可以组装更多片段，进行片段编辑，以及进行寡核苷酸拼接并且效率更高。但是，它的组装是在体内（酵母中）进行并且得到最终质粒需要更长的时间，因为酵母的生长周期比E. coli长。请使用这一表格来选择最适合您应用的GeneArt Seamless克隆和组装试剂盒。

在线工具不能自动进行片段编辑，但是可以用它来手动进行片段编辑。用户手册中有一个章节是关于片段编辑的，并且给出了如何使用在线工具进行片段编辑的示例。

请使用这一表格来决定最适合您的应用的克隆方法。对于简单的PCR克隆或将小于5 kb的基因亚克隆到一个载体内，我们的常规TA或TOPO TA试剂盒是最佳选择。Gateway 是最好的表达平台，它适用于在不同宿主系统内进行蛋白表达，或者在日常实验工作中将基因从一个载体转移到另一个载体上，而无需使用PCR扩增该基因并重新克隆。GeneArt克隆和组装试剂盒适合于需要将超过一个DNA片段同时克隆进一个载体的用户，或者那些需要克隆较大（超过5 kb）DNA片段而其它克隆方法效率很低的用户，以及那些需要将DNA片段进行无缝连接而不添加额外序列的用户。这些新平台也是非常灵活的，并且用户可以使用他们自己的载体制作最大达到110 kb的DNA质粒。

克隆效率根据带有末端同源性的片段数目的不同而有很大的不同。请参见下列对于将片段组装进pYES1L载体时克隆效率的大致估计：

• 5个DNA片段每个10 kb， > 90%
• 10个DNA片段每个5 kb， > 90%
• 10个DNA片段每个10 kb， > 50%

对于使用“Stitching”DNA寡核苷酸的方法将已经存在的无末端同源性的片段组装进入pYES1L载体，通常的克隆效率如下：

• 1个10 kb片段， > 90%
• 2个片段每个10 kb， > 75%

不会，您可以使用产生平末端或末端加A的酶。克隆效率不受影响。

pYES1L载体，一个9.4 kb线性化的YAC-BAC穿梭质粒，是在MaV203细胞中进行DNA片段组装的对照载体并且可用来将组装后的重组DNA分子转移到E. coli中。如果需要，您也可以将它用作克隆载体。酵母的复制起始位点是Chromosome II的中心粒（单拷贝，高效能YAC）。E. coli的复制起始点是F’ ori （单拷贝，高效能BAC）。壮观霉素可以用来进行E. coli筛选。试剂盒内包含可用于4次反应（1管，8 µL）的pYES1L载体。这对于对照反应或克隆您的插入片段，或者将两者结合都是足够的。pYES1L载体也可以单独出售（货号A13287，10次反应）。

大片段（>5kb）更容易在凝胶回收过程中受到损伤。因此，当使用PCR获得片段时，我们建议您在一次反应内组装多个小于5 kb的片段，而不是一个单独的大片段。另外，尽量减少DNA暴露于UV照射的时间和/或溴乙锭（EtBr）的使用量。如果您要将插入片段连入线性化的克隆载体，所有提供同源性的核酸序列必须位于引物的5'末端。如果您要连接相邻的两个片段，您可以将30至50 bp的同原序列分别置于不同片段（例如对于30 bp同源区的设计，将15 bp置于片段1的反向引物，15 bp置于片段2的正向引物，或者对于50 bp同源区的设计，将25 bp置于片段1的反向引物，25 bp置于片段2的正向引物）。请注意，您可以在相邻片段之间任意分配同源序列（例如对于30 bp的同源序列，可以使用上例中的15+15或20或20+10，25+5等等）。

对于单独的片段大小没有限制，只要组装后的10个片段和载体的总长不要超过110 kb。

裂解缓冲液仅作为试剂盒的一部分出售，不作为单独产品出售。

CSM培液可单独出售（货号A13292）。

用于插入编辑的stitching寡核苷酸除了插入碱基之外必须含有和每个相邻片段重叠的30bp核酸序列（最大长度80 mer，包括20 mer的插入碱基）。请参见用户手册内的图表。注意：这适用于2片段组装和插入仅适用于内部连接。对于其他的无缝连接，请使用40 bp重叠序列（即一个80 mer的寡核苷酸）。

用于删除编辑的stitching寡核苷酸必须含有和每个相邻片段重叠的40bp核酸序列，重叠区域可以离开片段连接处6个核苷酸处开始匹配，从而在每个片段末端有6 bp的序列可以在转化介导的重组中被删除。请参见用户手册内的图表。注意：这适用于2片段组装和删除仅适用于内部连接。对于其他的无缝连接，请使用40 bp重叠序列（即一个80 mer的寡核苷酸）。

可以，您可以根据下列建议用GeneArt High-Order载体转换元件（货号A13291）将您的E. coli载体改造为酵母兼容的克隆载体用于 GeneArt High-Order遗传组装系统：

• 使用DNA Oligo Designer在线工具，确认您的载体和GeneArt High-Order载体转换元件没有内部同源序列以避免在GeneArt High-Order遗传重组系统内使用您的改造载体时出现可能的重排。
• 如果最终质粒要被转移到E. coli中的话，对于1个大于15 kb的最终质粒，请使用一个带有单拷贝或低拷贝复制起始点的载体。通常，低拷贝质粒的效能显著大于高拷贝质粒。
• 避免在自己的载体上使用氯霉素抗性，因为转换元件是氯霉素抗性。
• 在连接后（建议使用1:10的载体：插入片段比），使用连接混合物转化E. coli细胞并涂板于双抗性LB平板上（氯霉素加用户载体上的抗生素标记）。要线性化酵母兼容的克隆载体用于多片段组装，需要进行一次双酶切以避免单酶切后产生的回文序列造成的背景。

DNA Oligo Designer是一款帮助您设计克隆载体和DNA片段的免费在线工具。它可以帮助避免特定序列连接时的潜在问题，并使用您的序列进行虚拟克隆。它也可提供一份最终组装后的质粒分子的图谱，以及一个可下载的和VectorNTI软件兼容的GenBank文件。请注意，该工具并不支持片段编辑。但是，对于删除编辑，您可以向DNA Oligo Designer中输入已经进行了末端删除的片段序列。要使用该工具请点击这里。

• 当使用推荐实验方案组装 ≤5个片段时，至少一半的克隆将包含顺序和方向正确的插入片段。
• 当克隆6个或更多片段是，我们建议筛选更多克隆，因为克隆效率会略微降低。

这里是一些对于引物设计的建议：

• 设计PCR引物，以便针对组装的每个DNA片段长度都在25 bp到10 kb之间。
  注意：大的插入片段（>5 kb）在凝胶提取过程中更易于受到损伤。此外，很多PCR酶的扩增能力不足以扩增>5 kb的插入片段。因此，我们建议在一次反应中组装多个≤5 kb的片段，而不是一次组装一个单独的大片段。
• 每对引物的5′末端（正向和反向）必须含有一个6核苷酸的末端缓冲区域（end-cushion segment），其后是限制性内切酶识别序列（6到7个核苷酸，取决定于所使用的酶）。
• 每对引物的3′末端必须有至少12个核苷酸的模板特异性序列。
• 引物通常不能含有内部互补序列以避免发夹结构的形成。同样的，在引物对之间也不能有互补序列。
• 引物中序列特异部分的Tm值在50至68摄氏度之间时得到的结果最好

我们还提供GeneArt Primer & Construct Design Tool可用于引物设计

所有三种GeneArt Type IIs组装试剂盒均包含pType IIs受体载体和pType IIs–CTRL载体。三种试剂盒之间唯一区别是试剂盒内的Type IIs酶混合物不同。为了使该系统得到最广泛的应用，GeneArt Type IIs组装试剂盒提供三种不同的基于非回文识别序列的酶混合物，这三种识别序列长度和GC含量（%）均不同：AarI (7 bp, 71% GC), BbsI (6 bp, 50% GC), 以及BsaI (6 bp, 66% GC )。所有三种混合物均包含所有需要的酶和非酶组分，并且作为单独的一管2X浓度的混合物提供，从而简化了实验设计，减少了移液步骤。我们建议根据所组装的片段的序列来选择合适的试剂盒。

• 在进行超过5个片段的组装，组装的片段<250 bp或 > 2kb时，如果想提高克隆效率和最终组装后得到的克隆数量，我们建议使用预克隆的DNA片段进行组装。
• 在进行至少有80%相同的同源序列或重复序列的组装时，我们建议预克隆DNA片段。您可以组装最多4个包含重复/同源序列的片段到一个供体载体，获得的重组子插入片段最大2.4 kb外加载体序列。预克隆的DNA片段长度必须在150 bp到600 bp之间。
• 要获得最佳结果，我们建议使用pCR™-Blunt II-TOPO载体（货号450245）作为您的预克隆供体载体。不要使用其它TOPO载体或带有额外AarI, BsaI,和BbsI识别位点的其它载体作为预克隆载体。

下表显示了使用预克隆DNA片段进行组装和直接使用PCR片段进行组装相比的优点：

如果有必要，您可以将您自己的载体改造后用作受体载体。改造后的载体必须包含ccdB基因作为反向选择标记，并且至少有一对相同的AarI, BsaI, 或BbsI内切酶识别位点分布在其两侧。如果在载体中出现多于一种Type IIs识别位点，则它们必须对称分布于ccdB反向选择标记两侧的MCS（多克隆位点）中。载体的MCS之外不能有任何其它的Type IIs识别位点。