引物设计技巧

良好的引物设计对于成功进行 PCR 反应来说至关重要。当为您的目标基因设计最佳引物时，需要考虑许多因素。以下是设计引物时需要考虑的一些技巧。

引物设计技巧

  • 通常，引物长度为 18-30 个核苷酸最佳。
  • 尝试使引物的熔化温度（Tm）介于 65°C 和 75°C 之间，并且差异在 5°C 以内。
  • 如果引物的 Tm 非常低，请尝试找到 GC 含量更高的序列，或稍微延长引物的长度。
  • 目标 GC 含量在 40% 至 60% 之间，引物的 3’以 C 或 G 结尾以促进结合。
  • 通常，在引物中的限制酶位点的 5’处加入 3 至 4 个核苷酸，便于有效切割。
  • 尽量避免二级结构区域，并平衡分布富含 GC 和富含 AT 的区域。
  • 尽量避免运行 4 个或以上单碱基或二核苷酸重复序列（例如，ACCCC 或 ATATATAT）。
  • 避免引物内同源性（引物内的互补性超过 3 个碱基）或引物间同源性（具有互补序列的正向和反向引物）。  这些情况可导致自身二聚体或引物二聚体的形成，而不是退火至所需的 DNA 序列。
  • 如果您使用引物进行克隆，我们建议将小柱纯化作为最低纯化标准。
  • 如果您使用引物进行诱变，请尝试将不匹配的碱基置于引物的中间位置。
  • 如果您使用用于 Invitrogen TOPO 克隆的 PCR 反应引物，引物应不具有磷酸修饰。

引物设计工具

使用 Vector NTI Advance 软件设计和订购引物

当使用 Invitrogen Vector NTI Advance 序列分析软件时，设计并订购引物大约需要 60 秒：

  • 选择要放大的区域。
  • 访问引物设计菜单并选择“放大选择”。
  • 根据需要将 5’和 3’限制性位点添加至有义和反义引物中。
  • 根据需要将其他碱基添加至有义和反义引物中。
  • 检查左侧窗格中的热力学参数，如 Tm、长度和 GC 含量。
  • 选择产品并点击“订购”。
  • 添加研究人员的姓名、所需的 5’或 3’修饰，或更改纯度。
  • 点击“添加至购物车”并开始结帐流程。
     

专题视频

了解有关 Vector NTI Advance 序列分析软件的更多信息，并查看有关该软件其他常用功能的其他视频。 

OligoPerfect 设计工具

Invitrogen OligoPerfect 设计工具是一款免费、简单、高效的基于 Primer 3 和云的引物设计工具，可与您上传的多达 50 个 DNA 的模板序列配合使用。与 Vector NTI Advance 软件一样，OligoPerfect 设计工具与我们的在线订购系统无缝连接，因此您无需剪切和粘贴序列。

引物设计工具

您可通过引物设计工具快速搜索、配置和订购 NGS 工作流程的 Sanger 确认步骤所需的引物。该数据库由约 650,000 个预设计引物对组成，用于对人外显子组和人线粒体基因组进行重新测序。

  • 我们的引物不含 SNP 和引物二聚体，具有高度靶标特异性，可在通用 PCR 条件下使用
  • 引物覆盖，适用于 Ion Torrent Ion AmpliSeq Exome Panel 和 Ion Torrent Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v.2 Sanger 验证工作流程
  • 灵活的引物配置，满足您的研究需求：引物可以是未经修饰、M13 尾结合的、HPLC 纯化或脱盐的
  • 所有引物均采用质谱进行检测，并已通过严格的生物信息学指标要求。实验室工作台验证检测结果显示，成功率 > 95%。
     

资源

订购详情

仅供科研使用，不可用于诊断目的。