寡核苷酸技术资源

偶联效率是影响可合成 DNA 长度的主要因素。碱基组成以及合成规模也是相关的影响因素。表 2（在问题 7 中）表明在偶联效率效率为 99% 时，合成的 95 聚体粗溶液中可含有 38% 的全长产物以及 62% (nx) 失败的序列。这是在不考虑其他化学影响（如脱嘌呤作用）的情况下。脱嘌呤作用主要影响 A 碱基。脱嘌呤的发生频率很低，但会随着引物长度的增加而显著增加。由于这些原因，我们将最大长度设定为 100 碱基，这是我们认为可以进行日常低成本合成的最大长度。

重要的是将寡核苷酸生产工艺中化学性质相关的自然发生突变与在某些应用中使用脱盐寡核苷酸时发生的感知突变区分开来。

自然发生的突变是寡核苷酸的化学合成的一部分，对于约含 30 个碱基的一段特定寡核苷酸发生单碱基插入或缺失的概率约为 2%。我们将会对此类寡核苷酸进行免费替换。

对于感知突变，在 DNA 合成后，通过在碱性溶液如氢氧化铵中温育而从固体支持物中释放出完整的 DNA 链。该溶液含有所需的全长寡核苷酸，但也含有在合成过程中中止的所有 DNA 链（失败序列）。如果合成 30 聚体，该溶液还将包含 29 聚体失效序列、28 聚体失效序列、27 聚体失效序列等。存在的失效序列的数量受偶联效率的影响。对于这种类型的寡核苷酸，在偶联效率为 99% 或 98% 时，全长寡核苷酸的比例通常在 74% 至 54% 之间。如果您考虑定制更长的寡核苷酸，这一比例会更低。

由于寡核苷酸是从 3’至 5’端合成的，进行了脱盐而没有进行长度纯化的引物将会在 5’端出现碱基缺失。因此，进行了脱盐的寡核苷酸仅推荐用于诊断性 PCR、微阵列或测序。如果寡核苷酸将会被用于某些要求苛刻的应用（如诱变或克隆），特别是当在 5’端会加上限制性酶切位点时，我们推荐对寡核苷酸进行纯化。

其他脱盐及纯化后寡核苷酸感知突变的来源包括测序伪影、PCR 过程引入的点突变、引物中不稳定的茎环结构，以及质粒 DNA 克隆后在 muS、mutD、mutT 等 E. coli 菌株中进行扩增，或者因菌株中密码子使用而被相应菌株选择得到沉默突变。

DNA 合成这一复杂工艺在过去 10 年中得到了显著改进。尽管有所改进，但所有的生产厂商都会存在固有的失败率。我们不断开发我们的工艺和系统来将损失最小化，但不可避免偶尔也需要重新合成某些寡核苷酸。在订购时，您可以选择您是否愿意先收到订单上的一部分产品。

寡核苷酸的制备是通过使用 DNA 合成仪完成的，而该仪器本质上是一套由计算机控制的试剂递送系统。第一个碱基将会被连接至固体支持物（通常是玻璃或聚苯乙烯微珠），该支持物旨在锚定反应柱中不断延长的 DNA 链。DNA 合成由一系列的化学反应所组成。

表 1.制备寡核苷酸的步骤

每个反应循环都会加入一个 DNA 碱基。可通过重复合成循环直至达到期望的长度而完成 DNA 链的构建。

偶联效率是一种测量 DNA 合成仪将新碱基加至 DNA 链的效率的方法。

如果 DNA 链上的每个可用碱基都能与新的碱基成功进行反应，则偶联效率为 100%。几乎没有化学反应是具有 100% 效率的。在 DNA 合成过程中，可达到的最高偶联效率通常约为 99%。这意味着在每个偶联步骤中约有 1% 的可用碱基不能与加上的新碱基发生反应。

三苯甲基基团连接在 DNA 碱基上时是无色的，但在被移除后会呈现特征性的橙色。相应颜色的强度可通过紫外分光光度计进行测量并与存在的三苯甲基分子数量直接相关。通过比较因合成而被释放的三苯甲基的吸光值，就可能计算成功偶联碱基的比例，进而得出偶联效率。

偶联效率十分重要，因其在 DNA 合成过程中作用是逐渐累加的。表 2展示了 1% 偶联效率差异的影响，以及它将如何影响合成不同长度寡核苷酸后可用全长产物的量。即便是对于相对较短的 20 碱基寡核苷酸，1% 的偶联效率差异也意味着合成后 DNA 全长产物产量会有 15% 的提高。

表 2.偶联效率将如何影响合成寡核苷酸的纯度

全长寡核苷酸的比例取决于化学合成的偶联效率。平均效率接近于 99%。如需计算全长寡核苷酸的比例，可使用公式：0.99n-1 因此，管中 79% 的寡核苷酸分子长度为 25 碱基；其余长度 <25 碱基。如果对于使用所制备的全长寡核苷酸开始下一步实验存在担忧，您可以考虑进行纯化柱、PAGE 或 HPLC 纯化。

将寡核苷酸溶解于 TE [10 mM Tris-HCl (pH 8.0)，1 mM EDTA]。相对于去离子水，更加推荐使用 TE，因为水的 pH 通常会呈弱酸性并因此导致寡核苷酸的水解。

冻干的寡核苷酸可在 –20°C 稳定保存至少 1 年。溶解于 TE 的寡核苷酸可在 –20°C 或 4°C 稳定保存至少 6 个月。在无核酸酶的情况下，溶解于水的寡核苷酸可在 –20°C 稳定保存至少 6 个月。确保所用的水具有中性 pH 以避免脱嘌呤作用。不要将溶于水的寡核苷酸在 4°C 下保存。

理想的 PCR 引物对只会与靶标两侧的独特序列结合，而不会与样本中其他序列结合。设计不好的引物还可能会扩增其他非靶标序列。以下指南描述了引物序列应有的特征：

• 通常引物具有 18 至 24 个核苷酸。
• 选择具有 40% 至 60% GC 或与模板 GC 含量相当的引物。
• 避免在引物对的 3’端存在互补序列。
• 避免高 GC 的 3’端。
• 在引物的 5’端及中央区域设计 G 或 C 碱基。
• 避免在 3’端与靶标存在错配。
• 避免可潜在形成内部二级结构的序列。

当为 PCR 分析订购定制寡核苷酸时，合成规模决定了所提供的反应数量。下表假定 PCR 反应为 100 μl，寡核苷酸最终浓度为 0.1 至 0.5 μM。

表 3.用于 PCR 应用的寡核苷酸规模

引物的重要参数之一是熔解温度 Tm。这是 50% 的引物及其互补序列处于双链 DNA 分子的温度。Tm 对于确定 PCR 的退火温度是必要的。合理的退火温度在 55°C 至 70°C 之间。退火温度通常比引物 Tm 低 5°C。由于大多数公式只能提供 Tm 的估计值，所以退火温度只是尝试的起点。还可通过不断提高退火温度对多组反应进行分析来提高 PCR 的特异性。

当需要对浓度和体积归一化时，所选择的值必须等于或低于在所选起始合成规模订单（板）中最长寡核苷酸 OD 保证值的 nmol 预估值。例如，一个起始合成规模为 25 nmol 的 20 聚体订单，要求浓度为 100 µM 而体积为 100 µl，这些参数与 2OD 相符，或近似于 10 nmol，此即基于以下计算得出的最低终产量保证：

[µM 浓度] x [µl 体积] = [pmol 产量]，且 [1000 pmol = 1 nmol]

因此，[100 µM] x [100 µl] = 10000 pmol = 10 nmol

为了获得等于或大于最低保证终产量的整体合成产量，可在订购时仅对浓度值进行要求。订单中的每一条寡核苷酸都会按要求的浓度以不同的体积（整体合成产量）进行提供。